石蜡切片技术原理

显微标本制作技术河北大学细胞生物学实验室一、实验原理显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。二、实验方法生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类：非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等。切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手段。1.1涂片法主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。1、非切片法1.2铺片法主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如:洋葱表皮细胞的铺片制备。1.3压片法一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。1.4离析法该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色，脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶片，茎等部位。1.5磨片(Groundsection)用于很坚硬的组织，如骨和牙。2、切片法切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法，为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。下边以石蜡切片为例，介绍显微标本的制备方法。2.1取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。2.1.1动物的麻醉和杀死从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用1g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。2.1.2动物组织块的切割割取动物组织块时，需注意以下几点：第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。第二，应注意切割方向．如在管状器官(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2-3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。2.2固定割取组织块后，应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。2.2.1固定的意义新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一种方法．将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。固定的目的和作用在于：①防止组织自溶和腐败；②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。2.2.2固定的方法固定有物理方法和化学方法两种。物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。2.2.3固定液的选择固定液的种类很多。可分为两大类：简单固定液和混合固定液。简单固定液又称单纯固定液，就是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液是有局限性的。混合固定液就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。2.2.4常用的固定液福尔马林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液）是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳类的固定。FAA液配方：福尔马林5m1冰醋酸5m150％或70％酒精90m1Bouin氏液是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。Bouin氏液配方：苦味酸饱和水溶液75份福尔马林25份冰醋酸5份此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定12—24h，小块组织数小时即可。固定后直接入70％酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间为12—48h。2.2.5固定的注意事项(1)固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。(2)材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液的比例为1:20。(3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。(5)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行抽气。(6)固定时，要防止材料变形。(7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液2—2h后，再将其修成小块材料继续则定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后．再行固定。(9)材料投入固定液后．须经常摇晃。(10)容器外需贴标签。2.3脱水脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。2.4透明透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。其过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。2.5渗蜡将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。2.6包埋样品经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。我们可以看到：①水和酒精可以相溶。②酒精和二甲苯相溶。③二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。2.7切片修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。2.8.1染料、染色液染料必须具备两个条件：①要具有颜色②和被染物体之间具有亲和力。如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，那只能是颜料或合色物质，而不是染料。染料的颜色和亲和力都是由分子结构决定的，即由产生颜色的发色团和与组织产生亲和力的助色团所决定。发色团：能使染料分子产生颜色的原子团称为发色团，也就是能吸收一定波长的光线并因之而呈现颜色的化学结构。助色团：能使染料对织物纤维或组织成分产生亲和力的原子团称为助色团，也就是使化合物具有成盐性质的原子团。2.8染色2.8.2染色剂的分类2.8.2.1根据来源分(l)天然染色剂此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。(2)合成染色剂全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。2.8.2.2根据用途分(l