乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测

乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测YLNB2.8一、凯氏定氮仪常量检测法1.原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。2.试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。2.1浓硫酸2.2硫酸钾2.3硫酸铜2.4氢氧化钠溶液：400g/L2.5硼酸溶液：30g/L2.6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95％的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。2.7硫酸标准溶液：c(H+)=0.1000±0.005mol/L2.7.1标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却后洗入1000ml容量瓶中，定容。2.7.2标准溶液的标定：（见GB/T601-2002）2.73硫酸铵：干燥后最低含量99.9%，使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。3.仪器及器材3.1凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪3.2消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）3.3接收瓶：300ml三角瓶或烧杯4.方法4.1样品称取4.1.1原料奶和纯牛奶样品：称取约5g4.1.2乳饮料：称取约8g4.1.3冰淇淋：称取约5g4.1.4乳粉：称取约0.5g4.2测量4.2.1消化4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g硫酸铜，然后加入15-20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化30分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至9档，继续消化直到消化液透明。4.2.1.2消化至呈透明的蓝绿色后，继续消化至少1小时。在此过程中消化液必须沸腾。注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器测量一个特定得样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。4.2.1.3消化结束后，消化液应是透明的。将消化管连同排气盖从消化器上移走，冷却到室温，冷却的消化液应是液体或在管底有少量的结晶体的液体。注：大量的结晶体可能是消化过程中酸损失的结果，它能导致检测结果偏低。为了减少酸的损失，可降低烟吸出的速度。4.2.1.4消化液冷却至室温后，移走排气盖，在每个管中慢慢加约20ml水，摇动呈旋涡状使其充分混合，保证分离出的结晶体全部溶解，再冷却到室温。4.2.2蒸馏把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸50ml，氢氧化钠65ml，蒸馏时间3—5min。注：蒸馏时间是根据接收液的体积达到200ml而得到的。4.2.3滴定4.2.3.1用pH为7.00和4.00的缓冲溶液校准电位滴定仪。4.2.3.2设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为4.60，并开始滴定。4.2.3.3记录结果。4.3空白试验按照4.2.1—4.2.3所写的步骤进行空白试验，在消化管中加入0.85g蔗糖，加入蔗糖的作用是使空白在消化过程中与样品消耗等量的硫酸。4.4回收试验4.4.1方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照4.1.1—4.1.3的步骤进行。4.4.2用0.12g硫酸铵加0.85g蔗糖进行测定。回收率应大于99％。4.4.3用0.18g色氨酸或0.16g盐酸赖氨酸（5.9）加0.67g蔗糖进行测定。回收率应大于98％。4.4.4在以上的两个回收试验中（4.4.2和4.4.3），低结果将说明过程失败和（或）硫酸标准溶液的浓度不准确。应检查凯氏定氮仪或重新标定硫酸标准溶液。5.结果计算5.1氮含量的计算样品中氮含量（g/100g）=100m0.014HCVV0其中：V——测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。V0——空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，ml。c(H+)——硫酸标准溶液H+的摩尔浓度，mol/L。m——样品质量，g。四舍六入的结果保留到0.01%。5.2蛋白质含量的计算蛋白含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以6.38即可。5.3回收率的计算用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量21.19％即可。6.允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5％。二、半微量凯氏定氮法1.原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。2.试剂2.1浓硫酸2.2硫酸铜2.3硫酸钾2.4过氧化氢溶液：体积分数为30％。2.5硼酸溶液：30g/L。取30g硼酸，溶解在1L水中。2.6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95％的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。2.7硫酸标准溶液：c(H+)为0.1mol/L。配制与标定同常量凯氏定氮仪测定法。2.8氢氧化钠溶液，质量比为400/1000。称取400g氢氧化钠，用1000mL水溶解，待冷却后移入试剂瓶中。3.仪器及器材3.1凯氏烧瓶：500ml或250ml。3.2定氮蒸汽蒸馏器。3.3滴定管：25ml。3.4三角烧瓶：250ml。4.方法4.1精密称取奶粉样品2g或10～20g液体样品（约相当于氮30~40mg），将样品放入凯氏烧瓶（3.1）中，加入10g硫酸钾（2.3）和1g硫酸铜（2.2），量取20ml浓硫酸（3.1），徐徐加入凯氏烧瓶中，混合。注：1.加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。2.加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338℃）,增进反应速度。10g硫酸钾将沸点提高到400℃，但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513℃会分解。3.加入硫酸铜的作用：作催化剂，使氧化作用加速。4.2凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗，用微火加热（小心瓶内泡沫冲出而影响结果），当瓶内发泡停止，稍加大火力。同时，可分数次加入10ml过氧化氢溶液（2.4）（但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入）。当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时继续消化0.5～1h（如凯氏烧瓶壁粘有炭化粒时，进行摇动或待瓶中的内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至呈透明为止）。然后取下并使之冷却。4.3将澄清的消化液小心移入100ml容量瓶中，以水洗三次凯氏烧瓶，洗涤液并入上述容量瓶中，冷却后稀释至刻度并摇匀。4.4吸取25ml消化液与定氮蒸馏器中，在冷凝器的下端放置一个盛有50ml硼酸溶液（2.5）、3滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂（2.6）的250ml锥形瓶，冷凝器下端的玻璃管在液面以下。将25ml氢氧化钠溶液慢慢地加入蒸馏瓶中（溶液应呈强碱性），迅速将塞子塞好，然后通入蒸汽进行蒸馏，蒸至液面达150ml时，提出冷凝管靠在锥形瓶的瓶壁，出液口在200ml刻度线以上，继续蒸馏，蒸至液面达200ml。注：1.蒸馏时可视蒸馏器大小，同时减少消化液和氢氧化钠的体积数，保证溶液应呈强碱性。2.蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接收瓶。火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接收瓶内液体会倒吸，造成实验失败。4.5用硫酸标准溶液（2.7）滴定至溶液出现酒红色为止，记录所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验，并在结果中加以校正。5.结果计算样品中蛋白质含量（g/100g）=10010025m0.014FHCVV0式中：v—滴定时消耗硫酸标准溶液的体积，ml；v0—空白试验消耗硫酸标准溶液的体积，ml；c(H+)—硫酸标准溶液中H+的浓度，mol/l；m—样品的质量，g；0.014—氮原子的摩尔质量，kg/mol；F—氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。注：空白试验仅不加入样品，操作步骤与样品相同。6.允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5％。7.注意事项7.1所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。7.2样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生大量的泡沫，可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。7.3有机物完全分解，消化液呈兰色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。7.4蒸馏装置不能漏气。7.5蒸馏前若加碱量不足，消化液呈兰色，不生成氢氧化铜沉淀。此时需要再增加氢氧化钠的用量。7.6硼酸吸收液的温度不能超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。7.7混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液，生成硫酸铵应为强酸弱碱盐，所以溶液呈酸性，指示剂应显红色。7.8蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒，其作用相当于沸石，用量如绿豆大即可。