第三章--细胞分离与破碎、蛋白质复性

第三章细胞分离与破碎、蛋白质复性contents1发酵液预处理2细胞分离3细胞破碎4包含体的分离和蛋白质复性第一节发酵液预处理1目的：分离菌体和其他悬浮颗粒；除去部分杂质和改变滤液性质2发酵液的性质：①产物浓度较低②悬浮颗粒小③固体粒子可压缩性大④粘度大⑤性质不稳定第一节发酵液预处理3常用的发酵液预处理方法：①降低液体的粘度：水稀释法、加热法②调整pH值③凝聚和絮凝凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，从而胶体体系不稳定。絮凝：在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。混凝：前两者的复合使用。第一节发酵液预处理④加入助滤剂助滤剂：不可压缩的多孔微粒。硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩等。悬浮液中大量的细微粒子吸附到助滤剂的表面上，其可压缩性下降了，滤饼疏松，过滤阻力降低了。⑤加入不影响目的产物的反应剂第二节细胞分离1重力沉降①特点：细胞体积小，沉降速度很慢②促进重力沉降的方法：使细胞聚集成较大的凝聚颗粒，提高沉降速度高分子絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺等无机的凝聚剂：中性盐（硫酸铝、氯化钙等）第二节细胞分离2离心沉降2.1离心沉降方式①差速离心（Differentialcentrifugation）生化工业中最常用的离心分离法，细胞的分离为一级分级分离。实际应用中根据实际物系的特点、分离目的和所需分离程度，选择适当的离心机转数和时间，可使料液中不同组分得到分级分离。②区带离心（Zonalcentrifugation）事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，再加待处理料液后进行离心。离心时，料液中各组分在密度梯度中以不同的速度沉降，形成各自的区带而得到分离。如蔗糖、CsCl、NaBr密度梯度溶液第二节细胞分离③离心沉降可分为：低速离心，高速离心，超速离心过滤式离心，沉降式离心冷冻离心，常温离心第二节细胞分离2.2离心分离设备：①实验室用离心机：离心管式转子离心机特点：间歇式操作各种形式的离心机转子第二节细胞分离②工业用离心机：管式离心机，碟片式离心机特点：可连续操作管式离心机管式离心机能澄清及分离流体物质，被应用于化学、生物化学、制药、血浆等研究领域。设备简单，分离效率高；但生产能力较小。碟式离心机碟式离心机是沉降式离心机中的一种，用于分离难分离的物料（例如粘性液体与细小固体颗粒组成的悬浮液或密度相近的液体组成的乳浊液等）。碟式分离机是应用最广的沉降离心机。碟式离心机可以完成两种操作：(1)液-固分离，称澄清操作；(2)液-液（或液-液-固）分离（即乳浊液的分离），称分离操作。第二节细胞分离3过滤（Filtration）①定义——利用多孔性介质截留悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。第二节细胞分离②过滤前处理通常发酵液的黏度大，其中的微生物体积小，造成过滤的困难在过滤前，一般需对料液进行絮凝或凝聚等预处理，此外可添加助滤剂提高过滤速度。第二节细胞分离③过滤方法：澄清过滤，滤饼过滤；重力过滤，加压过滤，真空过滤，离心过滤；切向流过滤第二节细胞分离④过滤设备：板框过滤机用于各种悬浮液的固液分离，适用范围广。应用于食品、环保、轻工、医药、化工、冶金、石油等工业。特别适用于大批量啤酒、白酒、葡萄酒、食用油等液体饮料的精滤或除菌过滤。板框过滤机第三节细胞破碎1细胞破碎的目的许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。第三节细胞破碎2细胞的结构不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。革兰氏阳性细菌的细胞壁结构革兰氏阳性（G+）细菌的细胞壁具有较厚（30-40nm）而致密的肽聚糖层，多达20层磷壁酸：是革兰氏阳性菌的特有的成分，可加强肽聚糖的结构。革兰氏阴性细菌的细胞壁革兰氏阴性细菌的外膜壁膜间隙O-特异多糖(O-polysaccharide)核心多糖(core-polysaccharide)蛋白质类脂A(LipidA)孔蛋白(脂多糖)磷脂分子脂蛋白第三节细胞破碎3目标产物的选择性释放选择性释放目标产物，使其他物质尽量少地释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，有利于下游分离纯化。第三节细胞破碎4细胞破碎技术4.1机械破碎：原理：细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。优点：处理量大、效率高、速度快，是工业规模的主要手段1.高压匀浆：①破碎原理：主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使细胞破碎。②特点：压力通常为20-70MPa；适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎；需冷却处理，以保护产物的生物活性。2.珠磨①破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞，细胞受研磨剪切和撞击而破碎。②特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多。3.撞击破碎①破碎原理：细胞冷冻后成为刚性球体，再进行高速撞击而破碎。②特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。4.超声波破碎①破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。②影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。③特点：适用范围广,适用于多数微生物细胞的破碎。但有效能量利用率极低，操作中产生热，需在冰水或有外部冷却的容器中进行,故不易放大，多在实验室使用。第三节细胞破碎4.2化学和生物化学法1.酸碱处理2.化学试剂处理：增大细胞壁通透性试剂：表面活性剂、螯合剂、有机溶剂、变性剂3.酶溶：利用溶解细胞壁的酶处理细胞不同的细胞用不同的酶：如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用Zymolyase、-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。4.自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法。•机械破碎法与化学破碎法的比较机械破碎法优点：处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。缺点：由于操作条件比较剧烈，往往容易造成细胞的过度破碎，不利于后续处理。化学破碎法优点：选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。缺点：适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。－由以上比较可知，两种方法各有利弊，把二者结合起来使用，则可起到取长补短的作用，能够得到很好的破碎效果。第三节细胞破碎4.3物理渗透法1.渗透压冲击法：①破碎原理：细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。②特点:温和，适用于易于破碎的细胞（动物细胞和革兰氏阴性菌）2.冻结-融化法①破碎原理：利用细胞在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破，经冻结－融化反复多次操作，即可达到破碎。②特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放；操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。3.微波加热法①作用机理：利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促进介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。②特点：具有穿透力强，选择性高，加热效率高等特点，可用来处理微生物、植物和动物细胞提取胞内有效成分。但只适用于对热稳定、具有良好吸水性、不易变性或糊化的产物。细胞破碎技术高压匀浆珠磨破碎撞击破碎超声破碎机械破碎法化学试剂处理酶溶化学破碎法渗透压冲击法冻结－融化法物理破碎法细胞破碎法第三节细胞破碎5破碎率的测定①直接测定法②目标产物测定法③导电率测定法第三节细胞破碎6研究和发展方向①多种破碎方法相结合②与下游过程相结合③与上游过程相结合，如细胞的培养条件、基因工程等第四节包含体的分离和蛋白质复性1包含体（inclusionbodies,Ibs）①很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物不分泌到细胞外，而在细胞内凝聚成的无生物活性的固体颗粒。②特点：包含体中基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，因而无生物活性。③目的：分离包含体，并溶解包含体使目标蛋白质恢复天然的构型和活性。kikrUINkaA简化的蛋白质折叠动力学模型从该模型可明显看出，蛋白质复性的主要挑战就是创造适宜的复性条件，最大程度地抑制聚集体的生成，提高复性收率。第四节包含体的分离和蛋白质复性④包含体的特性包含体的密度较大，低速离心即可沉淀，分离出来。⑤包含体中的溶解及复性以变性剂溶解包含体，使成为可溶性伸展态，然后除去变性剂使表达产物再折叠，恢复天然构型。变性剂：盐酸胍、脲2蛋白质复性流程整体路线：破碎细胞→分离出包含体→溶解包含体→目标产物的构型复原具体路线可分为：1、机械破碎（高压匀浆，高速珠磨）→离心法提取出包含体→加变性剂溶解→除变性剂复性2、机械破碎→膜分离除可溶性蛋白→变性剂溶解包含体→除变性剂复性3、化学破碎（加变性剂）→离心除细胞碎片→除变性剂复性3包含体复性3.1稀释复性稀释复性是最简单和最常用的传统复性方法。根据操作模式可分为：①直接稀释复性：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，蛋白质开始复性。此法易于扩大，但增大了加工的液量，降低了蛋白质的浓度。②透析、超滤：将溶液对水或缓冲液透析，变性剂透过膜被除去，里面的蛋白质开始复性。此法不增加液体体积，不降低蛋白质浓度，但时间较长，易形成蛋白质沉淀。3包含体复性——稀释复性研究中发现，蛋白质复性收率随浓度提高而降低，间接反映了聚集体生成速率随浓度提高而增大。③流加复性：即将变性蛋白质分多批次加入到复性液中。可保证在液体中的变性蛋白质浓度始终保持在较低的水平，最终可在较高的蛋白质浓度下获得较高复性收率。3包含体复性3.2辅助因子作用在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体的生成。需要注意的问题：①选择性②最佳辅助浓度③最佳浓度与蛋白质种类及浓度的关系④延时性⑤尽量减少加辅助因子⑥后续的分离问题3包含体复性3.3分子伴侣和人工分子伴侣分子伴侣：一类热休克蛋白质，在体内和体外都具有抑制蛋白质伸展肽链错误折叠和聚集、促进肽链折叠成天然活性肽的作用。3包含体复性3.4复性色谱即利用色谱柱辅助蛋白质复性的方法，如凝胶过滤色谱、金属螯合色谱、亲和色谱等。思考题1.发酵液预处理的目的、方法？2.常用的细胞分离方法有哪些？3.常用的细胞破碎方法有哪些？