EP6.0-2.6.12微生物限度检查

2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）本章包括两种检验方法。第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。A．欧洲药典方法该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（MostProbableNumber,MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。任何选择的方法必须通过合理的验证。当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。样品制备：抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。抽样检验的结果依赖于下列因素：如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。除了特别说明外，取10g或10ml物质或制剂检测，釆取上面提到的预防措施。从大批样品中随机选择样品或从制剂容器中随机抽取。如有必要，为了获得所需的样品，将容器中大量的内容物混匀以保证每一份样品都能包含在内，是否要这样做依赖于所检测物质或制剂的性质。现举例说明适用于产品的抽样检验方法，而在该法中关于微生物分布状态的同质性方面可能存在问题，该例包括三类抽样检验方法。在该例中有从每批中分别抽取五份样品。以下是三种方法：（i）可接受的样本：例如：样品包括不少于mCFU(菌落数)/gorml,m代表在相关专论中特定指出的限度。（ii）边缘样本：例如：大于mCFU而小于10mCFU/gorml.（iii）有缺陷的样本：例如：包含大于10mCFU/gorml.水溶性产品：溶解或稀释10g或10ml待测产品于氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液。但是，根据产品特性或所需的敏感性可以考虑其它比例的溶液。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。不溶于水的非脂溶性产品：将10g或10ml待测产品悬浮于氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液，但根据一些产品特性或所需的敏感性需要更大体积的液体。可以添加合适的表面活性剂如1g聚山梨醇酯80来帮助不易润湿的底物悬浮液稳定。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。脂溶性产品：取10g或10ml待测产品与不多于一半质量的灭菌聚山梨醇酯80或另一种灭菌表面活性剂混匀，如有必要可加热，但不超过40℃，如有例外情况下也不应高于45℃。仔细混匀，如有必要可以维持温度在水浴中或恒温器中。加充足的预热过的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液制成一倍或10倍原产品的稀释液。仔细混匀同时维持温度使其能在最短时间内形成乳液状，但无论如何不要超过30分钟。此外必须准备一系列10倍氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液包含有合适浓度的灭菌聚山梨醇酯80或其它灭菌表面活性剂。贴剂：用无菌镊子除去10批贴剂的表面保护膜（“线性释放”），将它们平放，粘性表面向上放于无菌玻璃或塑料皿中。如有必要，粘性表面用无菌纱布（或纤维聚合物过滤膜）覆盖，然后转移这10批到最少500ML的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液中，该溶液添加有适当的灭活性如聚山梨醇酯80和/或卵磷酯。剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）。用同样的方法准备另10批样品，将它们放在最少500ML肉汤稀释液D中，剧烈振荡至少30分钟（得制备液B）。样品检测滤膜法：所用滤膜膜孔直径不大于0.45微米，并且滤膜高效截留细菌的能力已知。选择该种滤膜是因为用这种方法使细菌仍然侧够保持高效性同时不影响所测样品的成分。例如硝酸纤维素滤膜可以使用于水溶液，油溶液和弱醇溶液。醋酸纤维素滤膜可以用于弱醇溶液。设计过滤器的目的就是转移培养基中的过滤物。按照样品制备方法立即转移适量的制备样品（最好取有代表性的1g样品，如果所预期的菌落数多可以少点）分别到两层滤膜和滤器上。每个过滤器洗三次，每次用大约100ml合适的液体如氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液。在该溶液中可以加入适当的表面活性剂如聚山梨醇80或抗菌试剂的灭活性。如果用于验证，则不少于三次洗涤。如果主要是为了测定列举的细菌，则转移一个滤膜到合适的琼脂糖表面如介质B或其它介质上，如果主要是为了测定列举的真菌类，则转移滤膜到适当的琼脂糖表面如介质C。培养琼脂糖介质B的平板在30-35℃，介质C的平板在20-25℃，培养5天，除非在短期内可得到可靠的菌落数。平板计数法要选择最多菌落数不多于100个菌落的平板，计算每克或每ml产品中的菌落数。当检测贴剂时，通过两层的无菌滤膜分别过滤50ml的制备液A。将一个滤膜放置到琼脂糖B介质中用来计算总的需氧微生物菌落数，另一个滤膜到琼脂糖C用来计算真菌的菌落数。平板菌落计数法a.平板灌注法利用直径9cm的有盖培养皿，向每个培养皿中加1ml上述按样品制备方法制备的样品，然后再加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），在不高于45℃的条件下培养。如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。除非在短期内可以得到较好的菌落，一般情况下将平板在30-35℃下培养5天（真菌在20-25℃下培养5天）。对每一种稀释液选择一种相应的平板，最多菌落数不少于300（对于真菌不少于100）。计算菌落平均值和计算每克或每ML中菌落形成数。b.表面延伸法利用直径9cm的有盖培养皿，在每个平皿中，45℃下，加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），然后使其固化。如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。干燥平板，例如在层流柜中或恒温培养箱中。涂定量但不超过0.1ML的按照上述制备方法制取的样品于上述平板的表面上。对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。同平板灌注法一样培养和计算菌落数。最大可能数（MPN）计算法表2.6.12.1－细菌的最大可能数在每一稀释条件下3个试管阳性试管数MPN/g类型95％可信任限度0.1g0.01g0.001g120003--0103x1171003x1211017x2271107x22812011x4352009x23820114x54821015x55021120x86122021x86330023x712930138x1018031043x2021031175x2028032093x30390321150x50510322210x80640330240x1001400331460x20024003321100x30048003331100--类型1：正常结果，95％可信类型2：不太可能的结果，只有4％的可信度这些结果不用于重要决定，比类型2还不可能的结果并未提到，这种结果也总是不可接受。MPN的精确度和准确度不低于微孔滤膜法或平板菌落计数法。特别对于列举的霉菌通常会得到不可信的结果。因为上述原因，MPN法通常只有在没有其它合适的方法可用时才用来测定细菌。如果该法可行，则方法如下：按照样品制备法准备至少3个梯度的10倍稀释液。对每一个稀释液，在3个试管中分别接种1G/ML的样品液在9-10ML合适的液体介质中（如肉汤介质A）。如有必要，表面活性剂如聚山梨醇酯80或抗生素试剂灭活剂可以加到该介质中。因此如果准备了3个梯度的稀释液则需要接种9个试管。所有试管在30-35℃下培养5天。记录每种稀释液的试官微生物的生长情况。如果根据所测产品特性结果不好读或不确定，可以在同样的肉汤中再次培养，或在合适的琼脂糖介质中培养（如琼脂糖介质B），在同样的温度下培养18-24h,然后使用该结果。从表2.6.12-1表格中确定每克或每ML产品中细菌的最大可能数。高效的培养介质和有效的计数方法将合适的细菌试验株分别在含有合适的液态介质（如肉汤介质A）的容器中在30-35℃下培养18-24h。真菌试验株在合适的琼脂粮介质（如无抗生素的介质C）中在20-25℃下培养48小时如白色念珠菌，对曲霉菌在20-25℃下培养7天。金黄色葡萄球菌例如ATCC6538（NCIMB9518,CIP4.83）大肠杆菌例如ATCC8739（NCIM8545,CIP53.126）枯草芽孢杆菌例如ATCC6633（NCIM8054,CIP52.62）白色念珠菌例如ATCC10231（NCPF3179，IP48.72）黑曲霉菌例如ATCC10231（IMI149007，IP1431.83）用每ML氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液中大约含有100个形成菌落的悬浮液作为对照品。用分别含有各种微生物的悬浮液作为计数法的控制，悬浮液分别加有被测产品和不加被测产品。当用微孔滤膜法或平板计数法时，对于任何测定的微生物接种所得计算值不相差5倍。对于从MPN法接种所得的计算值要在95％可信限度内。为了检验介质和稀释液的无菌状态，用无菌的氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液作为测试液。在其上必须没有微生物生长。结果解释细菌数与琼脂糖介质B中的菌落平均数相等。真菌数与琼脂糖介质C中的菌落平均数相等。总的需氧菌数是上述两种菌之和。如果有证据表明同种类型的微生物在这两种介质中生长则结果就是正确的。MPN法所计算的值是细菌数。专论中所规定的限度解释如下：102微生物：最大可接受限度：5*102103微生物：最大可接受限度：5*103等。如果使用抽样方式，如三步抽样法过程如下：对每五个样品分别计算总的需氧菌数。如果按照下面条件操作，则物或制备液通过了测试：(i)没有单个的总需氧菌数超过了所预计限度的10倍或更多（如没有不可接受的样品）(ii)不超过2个的总需氧数在预计限度和10倍限度之内（如没有两个边缘样品）所推荐使用的溶液和培养介质将2.6.13中讲到。B．协调法：非无菌产品的微生物限度试验：微生物列举试验1.简介：该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制备液是否符合微生物质量已制定的规定。如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来解释结果。该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。可以使用自动收集法作为替代法，与药典所用方法具有同样效力。2.一般操作过程设计方法时所用条件要避免外在微生物对产品的污染。必须釆取措施避免污染以便它们不影响任何所测微生物。如果所测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。如果在样品制备中加了表面活性剂