微生物学实验

微生物学实验工艺学院一、实验教学目标基本与要求1、明确培养基的配制原理。2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。二、实验内容1、介绍培养基的配制原理和方法步骤2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基等。实验一培养基的制备称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。三、培养基的制备过程2.配调向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。3.调节pH值培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。五、问题和思考l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?实验二消毒与灭菌一、实验教学目标与基本要求了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。二、实验内容：1．干热灭菌法2．高压蒸汽灭菌3．紫外线灭菌法三、实验步骤（一）干热灭菌法1、原理利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度(160-170℃)，时间长(1-2h)。注：干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。2、步骤恒温降温开箱取物升温装入待灭菌物品（二）高压蒸汽灭菌1、原理利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min2、步骤加水装待灭菌物品加盖加热灭菌时间到后断电源压力降为零开箱取物（三）紫外线灭菌法1、原理紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧或使水氧化生成H2O2。O3和H2O2均有杀菌作用。适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。2、步骤1）单用紫外灯在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，再用紫外线灯照射15imn四、实验报告记录无菌检查结果五、问题和思考1.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.过滤除菌应注意哪些问题?实验四微生物接种技术一、教学目标与基本要求：掌握各种微生物接种的基本操作技术。二、实验内容1．斜面接种2．液体接种3．穿刺接种4．平板接种三、实验步骤将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。常用的几种方法如下：斜面接种液体接种穿刺接种平板接种1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。斜面接种示意图2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。四、问题和思考1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2.接种时，为何要尽量使试管平放？一、实验目标与基本要求：学习并掌握观察放线菌形态的基本功方法，了解放线菌的形态特征。二、实验内容：观察放线菌菌落形态。三、材料：1、菌种：白色链霉菌、红色链霉菌。2、0.1%美蓝染液、载片和盖片。实验八放线菌的形态观察四、步骤1、菌落形态及菌苔特征：以无菌操作分别取白色链霉菌、红色链霉菌制成菌悬液在平板培养基上用划线法接种，25-28℃培育5-7天，观察菌落的表面形状、大小、颜色和边缘等；并注意放线菌在基质上着生紧密情况。区别基内菌丝，气生菌丝及孢子丝的着生部位，取斜面培养的白色链霉菌、红色链霉菌观察菌苔特征，注意孢子颜色，营养菌丝颜色和色素分泌情况等。A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌2、个体形态特征的观察取一个平板，选择菌丝和孢子生长较薄的部位，直接置于低倍镜和高倍镜下观察。或用接种铲连同菌苔一薄层培养基取下一小块，平置于载玻片上进行观察，注意放线菌菌丝直径大小，孢子丝的形状。链霉菌形态观察放线菌的孢子丝描绘图3、孢子形状的观察（印片法）：取一盖片，轻轻放在菌落表面按压一下，使孢子贴附在盖片上，然后在载片上加一小滴0.1%美蓝染液（或加一滴水），将盖片带有孢子的面向下，盖在染液上，用吸水纸吸去多余的染液，在高倍镜或油镜下观察孢子形状以及断裂方式。四、实验报告绘图玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态。五、问题与思考1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2．用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?一、实验目标与基本要求学习并掌握酵母菌和子囊孢子的观察方法。二、实验内容1．观察酵母菌菌落形态2．制作酵母菌常规涂片，染色并用油镜观察菌体和子囊孢子。实验九酵母菌的形态观察三、实验步骤：1、菌落特征和菌苔特征的观察：取啤酒酵母，面包酵母用划线的方法接种在平板培养基上，28-30℃培养3天，观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养机结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、假丝热带酵母观察菌苔特征。啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。2、个体形态与出芽生殖用水浸片法观察，根据酵母菌是否染上兰色可以区别细胞的死活（这里的利用美蓝是一种弱的氧化剂，还原后变为无色的特性，活细胞具有还原力，故将其还原变为无色）。酵母菌的芽殖过程1．泡；2．小管；3．核；4．液泡3、裂殖酵母的观察：用水浸片法观察。酵母菌子囊孢子的形成过程1、2、3、4：两个细胞结合；5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子酵母菌假菌丝的形成图中1、2、3、4·······是出芽的顺序a、培养一划线法将假菌丝酵母接种在麦芽汁平板上，在划线部分加盖玻片，培养2-3天。b、制片与观察取下盖玻片，盖在加有一0.1%美蓝的载玻片上（即水浸片法），即可观察菌体呈树枝壮分支。或直接将培养皿放在低倍镜下观察。4、假丝酵母的观察：水浸片法观察5、子囊孢子的观察将面包酵母接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中，28-30度培养24h，如此连续传代3-4次，使其生长良好，然后转到醋酸钠斜面培养基上25-28度培养3天。用水浸片法制片或用芽孢染色，观察子囊孢子形状，并注意每个子囊内的子囊孢子数目。四、实验报告绘图1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。2．数个子囊及子囊孢子形态图。六、问题和思考酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?一、实验目与基本要求：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，了解常见霉菌的基本特征。二、实验内容：1．观察霉菌菌落形态。2．用显微镜观察霉菌装片。3．制作霉菌装片并观察其形态。实验十霉菌的形态观察三、实验步骤（一）菌落特征的观察用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。1.菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。2.菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。3.菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。霉菌菌落各种曲霉的菌落各种病原真菌的菌落青霉的菌落青霉的菌落霉菌菌丝A、无隔菌丝B有隔菌丝隔膜（二）个体形态特征的观察1.乳酸石炭酸制片法观察（1）制片：在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。（2）镜检：1）毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和葡萄菌丝。2）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列隔膜。3）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、小梗的排列方式，菌丝的隔膜。（3）将观察结果绘图，并注意各部分名称。霉菌的静孢子左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静孢子；右：囊轴曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子曲霉的分生孢子头彩图霉菌的厚垣孢子2.插片培养观察：（1）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。24到26度恒温培养2到4天。（2）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，有菌面朝下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻片上。四、实验报告绘制镜检形态图1．毛霉和根霉形态图，示各部。2．青霉和曲霉形态图，示各部五、问题和思考1．什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物，有何优点?2．湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?