DNA提取及纯化

--沼气发酵的物料理化特性及微生物群落多样性分析2．6质粒DNA的纯化、沉淀与贮存(1)在DNA溶液中加入1／10被体积的醋酸钾，终浓度为0．3M，充分混匀；(2)加入2倍体积的无水乙醇，再将溶液混匀，置于冰上15-30min(3)13000rpm离心10～15min，倒弃上清液，保留核酸沉淀块；(4)加75％的乙醇至管中2／3体积，混匀漂洗，除去残余的盐，然后置于4℃，12000rpm离心2min，弃上清，若盐杂质较多，可重复该步骤2．3次；(5)将沉淀倒置在吸水纸上进行自然干燥后，用适当的ddH20溶解DNA，置于4C或一20℃保存待用。2．7琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的检测DNA大小、含量及质量的方法。(1)根据DNA片段的大小，制备平板琼脂糖凝胶；(2)在待测的DNA液中，加入1／10体积的上样缓冲液，如溴芬蓝等；(3)将含loadingbuffer的待测DNA液点入凝胶的加样孔，加样量控制在10-30ul，并以标准DNA(常用λ／HindlII)作Marker；(4)当蓝色指示剂离胶前沿1／3处时，电泳完毕，EB染色约30min后，紫外灯下观察、照相；制胶及电泳参数：(1)分离观察大片段时需采用浓度低的凝胶，大约在0.5-0.7％左右，低压(1．5V·cm-1)和醋酸缓冲液(TAE：O.04MTris-醋酸，0.001MEDTA)下进行电泳；(2)分离两个大小相近的片段也可用TAE缓冲液；要检测小片段时则用浓度较高的凝胶，约为0．9～1．5％左右，在高压(8V·cm-1左右)和硼酸缓冲液(TBE：0．089MTris-硼酸，0.0002MEDTA，pH8．0)电泳。注意：EB染色时，操作必须使用医用乳胶手套。2．8样品总DNA的提取与纯化2．8．1样品总DNA的提取样品总DNA的提取采用直接提取法或试剂盒提取，直接提取法参考文献的方法略有修改，直接提取法步骤如下：(1)所加的提取缓冲液终浓度：Sodiumphosphatebuffer100mMpH8．0Tris—HCI100mMpH8．0EDTA100mMpH8．0CTAB1％(w／v)NaCl1.5mol／L(2)提取步骤：取lmL样品到1.5mLEP管，12000rpm离心20min，倒去上清液，然后加入lmL提取缓冲液，吸打混匀，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次，加入溶菌酶(终浓度1mg／mL)和蛋白酶K(终浓度O．2mg／mL)，最后加入终浓度为2％的SDS(十二烷基硫酸钠)，混合均匀，在65℃水浴中放置60min，期间每10min颠倒混匀一次。处理后的样品用12000rpm离心20min，将上清液转移到另一个干净的EP管(注意勿将沉淀物带入)；在上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒EP管混匀，10000rpm离心10min，重复一次；取上清到另一个干净的EP管，加入0．6倍体积的异丙醇，混匀，12，000rpm室温离心15min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀块两次，在室温下自然干燥，用适量灭菌双蒸水溶解，-80℃冰箱保存。试剂盒提取：采用OMEGA公司的SoilDNAKit提取，提取方法和操作步骤按说明书进行。