紫色非硫光合细菌培养特性的研究

紫色非硫光合细菌培养特性的研究摘要:采用光合细菌中的紫色非硫菌为材料,通过单因素试验和正交试验研究了pH、温度、光照、氧气以及接种量对其生长繁殖的影响。结果表明,pH、光照、氧水平、接种量对紫色非硫光合细菌生长的影响达到了极显著水平。PH为710,日夜交替光照、微氧条件,接种量为20%是紫色非硫光合细菌培养的最佳条件,这为快速培养高活性的光合细菌奠定了理论基础。关键词:光合细菌;培养条件;正交试验Studyonculturecharacteristicsofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteriaAbstract:Theresultindicatedthatthegrowthofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteriawasinfluencedbythepH,tem-perature,illumination,oxygen,andtheinoculationquantity,respectivelyatthe0.01remarkableleve.lpH7.0,dayandnightinturnillumination,microoxygen,and20%inoculationquantitywerethemostsuitablecultureconditionforthegrowthofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteria.Keywords:photosynthesisbacteria;culturecondition;orthogonalexperiment光合细菌(Photosyntheticbacteria,PSB)是一类能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核生物的总称[2]。它是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物,生命力极强,广泛存在于自然界的水田、湖泊、江河、活性污泥及土壤内,在腐败有机物质浓度高的水域中更为常见[2]。紫色非硫光合细菌也称红螺菌科光合细菌,是兼性厌气菌和光能利用菌。其细胞富含蛋白质、氨基酸及胡萝卜素等多种生物活性成分,并且有固碳、固氮、脱氢和氧化硫化物等多种生理功能[3]。由于紫色非硫光合细菌具有丰富的应用价值和独特的生理生化特性,这使得它在农业、渔业、环保、医药及能源开发等方面有较高的应用价值,同时还被作为研究光合作用和生物固氮的材料[4-8]。目前,有关光合细菌生长培养的研究已有报道。如植物激素(三十烷醇,A-萘乙酸和赤霉素)、中草药(枯楼、木瓜、蒲公英和枯梗等中草药浸提液)、槲寄生等对光合细菌的生长均有明显的促进作用[9-12];某些重金属离子对光合细菌的生长则有明显抑制效应等[13]。但关于氧气、温度和光照等因素对光合细菌影响的研究报道甚少,且不同的研究其结果不尽相同。随着人们对光合细菌的开发应用价值的不断认识,光合细菌的增殖培养将越来越受到重视。因此,研究光合细菌最佳培养条件,使其应用得以大范围推广,意义重大而深远。本研究主要通过对pH、温度、光照、氧气以及接种量等影响因素的研究,探究紫色非硫光合细菌生长繁殖最佳条件。旨在为紫色非硫光合细菌生产应用和科学研究提供一定的参考价值。1材料与方法111菌种来源试验所用的紫色非硫光合细菌-安徽工程科技学院生物技术实验室保藏菌株。112培养基培养基配方根据微生物生长必需元素并做适当修改。具体配方为:乙酸钠3100g、氯化铵3100g、酵母膏0110g、KH2PO40120g、MgSO4#7H2O01005g、Na2CO30120g、复合无机盐溶液1100m,l蒸馏水1000ml。复合无机盐溶液组成为:EDTA015g,FeSO4#7H2O012g,ZnSO4#7H2O0101g,硼酸0103g,MnCl2#4H2O01003g,CaCl2#2H2O0102g,NiCl2#6H2O01002g,CuCl2#2H2O01001g,Na2MoO4#2H2O01003g,水100m,lHCl调pH至310。113初始培养条件以质量浓度10%的接种量将菌种接种于250ml的盐水瓶中,调节pH至710,在25e恒温光照培养箱(1500lux)中进行微氧培养。其后每隔12小时测量一次培养液的OD值,同时调节pH至初始值。114菌种的活化由于使用的是保藏菌种,使用前必须进行菌种复活培养。将配制好的培养基在121e条件下灭菌30min。待培养基冷却30e后用25ml量筒量取25ml菌种液接种至盛有225ml液体培养基中的盐水瓶中,然后调节pH至710,并测量其初始吸光值(OD值);最后恒温光照培养箱中进行培养。115氧气对光合细菌生长的影响有氧条件:打开盐水45安徽农学通报,AnhuiAgri1Sci1Bull12008,14(15)瓶橡皮塞进行培养;无氧条件:将培养液装满整个盐水瓶,并塞紧橡皮塞使其密封;微氧条件:将培养液装至盐水瓶的四分之三,塞紧橡皮塞使其密封。116光照对光合细菌生长的影响全光照培养:将光合细菌置于光照强度为1500lux光照培养箱中进行培养;日夜交替光照培养:将光照培养箱设置每天06:00开启18:00点关闭,使光合细菌进行日夜交替光照培养;无光照培养:将光合细菌置于一密封纸盒内进行培养。115紫色非硫光合细菌生长状况测定试验选用721分光光度计,以未接种的液体培养基作为空白,在660nm波长下测定紫色非硫光合细菌菌液的吸光度(OD660)。以菌体浓度变化比来判断紫色非硫光合细菌的生长状况。菌体浓度变化比=ODm/OD0;其中OD0菌液培养初始菌体浓度,ODm培养m天后培养液菌体浓度。2结果与分析211pH对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大,主要作用在于引起细胞膜电荷的变化,从而影响微生物对营养物质的吸收以及代谢过程中酶的活性;改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。pH对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响如图1所示。可以看出,紫色非硫光合细菌在pH为5-9范围内均能正常生长,在培养第4d时,基本达到生长平衡期;培养到第6d时,其菌体浓度变化比分别为3199、7105、15125、14121和911。因此,pH值为7时,其紫色非硫光合细菌生长的最好。图1pH对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响212接种量对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响对于紫色非硫光合细菌的应用性培养,接种量是影响菌种能否在较短的时间内快速生长的一个重要因素。接种量太少不宜光合细菌的快速生长,而无限增大接种量,会造成种子菌液的浪费,且收到的效果不一定很明显。从图2可以看出,接种量为1%、5%和10%时,紫色非硫光合细菌生长较为缓慢,在培养过程中发现其菌液颜色较淡。而接种量为15%和20%时,其生长速率较快,在较短的时间内变成了粉红色,即第四天即达到平衡期。但15%和20%两种接种量对紫色非硫光合细菌生长的影响并不是很大。因此,从节约菌种和减少成本角度考虑,接种量为15%时更适合进行大规模培养。图2接种量对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响213温度、氧气对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响温度是紫色非硫光合细菌生长一个重要的限制性因素,适宜的温度对紫色非硫光合细菌的生长非常必要,一般来说温度不宜太低也不宜太高。温度对紫色非硫光合细菌生长状况的影响见图3。可以看出,在20e、25e、30e和35e下紫色非硫光合细菌均能生长,且30e更有利于紫色非硫光合细菌的生长,而20e条件下紫色非硫光合细菌生长较差。但总体来看,不同温度对紫色非硫光合细菌生长的影响并不是很大。紫色非硫光合细菌属于兼氧微生物,在有氧、无氧和兼氧条件下均可存活。目前,国内关于氧气对紫色非硫光合细菌生长繁殖影响的研究报道很少。本试验对无氧、微氧和有氧三个因素进行了研究,其结果见图4。从图4可以看出,在无氧、微氧和有氧的三种条件下紫色非硫光合细菌均能生长。当培养到第4d时,三者均达到生长平衡期,第6d时,在无氧、微氧和有氧条件下,其菌体浓度变化比分别为13108、15154和12173。可见,在微氧条件更利于紫色非硫光合细菌的生长繁殖,故生产上可以根据实际条件进行选择。图3温度对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响214光照对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响紫色非硫光合细菌虽然可以利用低分子量有机物,但其属于光能自养型微生物,可以像植物那样直接利用太阳能。故光照强度对其生长繁殖有着极为重要的影响。本试验研究了全光照、日夜交替光照和无光照三种条件对紫色非硫光合46安徽农学通报,AnhuiAgri1Sci1Bull12008,14(15)细菌三种繁殖的影响,其结果见图5。图4氧气对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响从图5中可以看出,无光照条件在很大程度上抑制了紫色非硫光合细菌的生长,其菌液呈淡红色,无沉淀。而全光照和交替光照均适合紫色非硫光合细菌的生长,在培养到第4d时基本达到了生长平衡期。第6d时,三种条件下其菌体浓度分别增加15141、16146和6145倍;观察菌液颜色和状态的变化,全光照的菌液呈红色,有微量红色沉淀;交替光照菌液呈深红色,有适量红色沉淀。因此,交替光照最适合紫色非硫光合细菌生长,这可能与其长时间适应自然条件的进化有关。图5光照对紫色非硫光合细菌生长繁殖的影响215正交试验根据单因素试验结果得出,pH、接种量、氧水平和光照水平对紫色非硫光合细菌生长的影响较大。因此,选取该四种因素进行正交试验分析其最优组合水平。正交设计及其试验结果见表1。由表1中的R值大小可知,各因素对紫色非硫光合细菌生长的影响大小依次为:接种量光照条件pH氧水平,即光照条件对紫色非硫光合细菌生长的影响最大,而氧水平对其影响最小。同时还可以看出,各因素的最佳组合为A1B3C2D2。即pH710、接种量20%、微氧和日夜交替光照条件下,最有利于紫色非硫光合细菌的生长。但考虑到节约菌种的角度出发,往往采取接种量为15%也是可行的。为了判断试验因素之间的差异是来自于随即误差还是来自于其本质的差异,对正交试验结果进行了方差分析,结果见表2。表1四因素三水平正交试验设计及结果分析处理号A(pH)B(接种量)C(氧水平)D(光照条件)菌体浓度比11(710)1(10%)1(无氧)1(全日光照)141770212(15%)2(微氧)2(日夜交替)241340313(20%)3(有氧)3(无日照)25126542(810)123131250522312313506231227162073(910)1321315858321321129093321261315K1,211792131868211227211478K2,211407231327211635221182K3,201397261400201733191935R113951215320190221247表2不同因素正交试验结果分析误差来源自由度(df)平方和(SS)均方(MS)FPrF重复10118200118201154012495pH26122873111435026138010003接种量25111896225519481216812610001氧水平221446211223110136010060光照水平215184817192406711310001误差8019443011180总和1753715456从表2方差分析的结果可以看出,pH、接种量、氧水平和光照水平四个因素的P值均小于0101,表明这四个因素的作用效果达到了极显著水平,从而说明它们对紫色非硫光合细菌的生长均有重要的影响,在紫色非硫光合细菌的实际生产过程中不容忽视。3讨论pH是影响紫色非硫光合细菌生长繁殖的关键性因素之一,pH过高或过低,紫色非硫光合细菌的生长均会受到抑制。郭晨[14]等认为紫色非硫光合细菌生长的最适pH在615-715之间,熊万永[15]等认为紫色非硫光合细菌生长的最适pH为710,而蒋火金[16]等认为紫色非硫光合细菌生长的最适pH在8-815之间。本研究结果表明,紫色非硫光合细菌增殖培养pH值为7-8时,其生长的较好,这与以上