实验一-双缩脲法测定蛋白质含量

实验一:双缩脲法测定蛋白质含量一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。二原理双缩脲()是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨(NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容量瓶（250ml、500ml、1000ml）、刻度吸管（1.0ml2.0ml5.0ml）试管（1.5cmX15cm）。四试剂1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250ml蒸馏水溶解后，一并转入1000ml容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。2、0.05ml/L的NaOH（需标定）。3、标准酪蛋白溶液准确称取0.5g酪蛋白（干酪素）溶于0.05ml/L的NaOH溶液中，并定容于100ml，即为5mg/L的标准溶液。4、未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。五方法与步骤1、标准曲线的绘制取12支试管分两组，分别加入0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml的标准蛋白质溶液，然后分别加入1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、、0.2ml、0.0ml蒸馏水，使每支试管总液量为1.0ml，最后分别加入4ml双缩脲试剂。充分摇匀后，室温下（20—25℃）放置30min，于540nm处进行比色测定，用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液，并取两组测定的平均值。以蛋白质的含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线绘制操作表见下。（共12支管，分两组，只列出一组。）管别试剂每组编号123456标准蛋白质溶液（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂（ml）4.04.04.04.04.04.0蛋白质含量（mg）0.01.02.03.04.05.02、样品测定（1）小麦样品的制备与测定①将磨碎过100目筛的小麦样品在80℃下烘至恒重，取出置于干燥器中冷却待用。②称取烘干样品约0.2g两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。然后各瓶加入5ml0.05ml/L的NaOH溶液湿润，之后再加入场20ml的双缩脲试剂（为什么？）振荡15min，室温静置反应30min，分别过滤（为什么？），取滤液在540nm波长处比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（mg）（为什么？）。（2）家畜血清样品的制备与测定①对动物空腹采静脉血，不加抗凝剂（为什么？）在室温与待自行凝固（5--10min），通常经3h，血块收缩析出血清。析出血清后及时分离之，以防溶血，并稀释10倍置于冰霜保存。②取两份血清，每份1.0ml，分别加入4ml双缩脲试剂，摇匀，37℃（为什么？），20min后用分光光度计于540nm波长处比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量。（3）每次测定中须用空白管调零。六结果处理从标准曲线上查得的蛋白质含量（mg）样品蛋白质（%）=—————————————————X100X酪蛋白的纯度样品重（mg）测定管光密度100测定管光密度被测血清总蛋白质（g/100ml）=———————X0.05X———=———————X5标准管光密度0.1标准管光密度七注意事项1、三角瓶一定要干燥，勿使样品（小麦粉）粘在瓶壁上。2、若用小牛血清（BSA）蛋白质含量（mg/ml）应以1mg/ml的A540（540nm波长吸光度）为0.66来校正其纯度。3、测定管与第6管操作同。八思考题1、分光光度法基本原理是什么？2、双缩脲测定蛋白质含量的原理是什么？3、为什么双缩脲法简便、快速而准确性不高？