转录调控基本方法-马珊珊

基因组与蛋白质组学技术马珊珊中山医学院药理教研室中山大学蛋白质组学研究中心转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株转录调控研究常用方法4.从源头寻找差异基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.启动子分析：确立启动子核心区预测启动子上的转录因子结合位点6.证明转录因子结合在启动子上：EMSA，ChIP7.蛋白质与蛋白质相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FRET，PLA…c-Jun靶基因及其对神经元凋亡的调控4意义神经元凋亡→AD、PD等神经退行性疾病信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点5JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路•撤NGF处理交感神经元•撤钾处理小脑颗粒神经元•β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元•黑质多巴胺神经元凋亡……678c-Jun的靶基因是什么？FasLMolCellBiol1999MolCellNeurosci2001JCellBiol2003BimNeuron2001Neuron2001NeurosciLett20059寻找c-Jun促凋亡靶基因－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡时上调2Ad-169抑制3促凋亡作用25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechipΔ169结构示意图腺病毒技术感染率80％各类病毒比较见下表病毒表达系统腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相关病毒Ad-associatedvirus病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒单链DNA病毒复制自主复制自主复制复制缺陷是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达感染细胞类型分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞表达丰度高水平表达中水平表达高水平表达表达时间快（1-2天）慢(2-4天)慢滴度滴度高达1012pfu/ml滴度最高可达109TU/ml滴度最高可达105TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过10kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过5kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak21415JNK/c-Jun介导dp5表达上调c-Jun直接调控dp5直接调控:c-Jun结合dp5启动子触发dp5表达确立dp5启动子核心区分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：GenomatixSuite：需注册ALGGEN：=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.html=TF_8.3Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？报道基因ATF位点是dp5上调的关键位点23c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？2425ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合ChromatinImmunoprecipitation(ChIP)28c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合dp5上调是神经元凋亡所必需29siRNA31JonathanHamLab33ATF位点介导c-Jun靶基因上调35反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCAc-Jun异二聚体的靶序列363738394041c-Jun/ATF2形成二聚体Immunoprecipitation(IP)c-Jun/ATF2介导ATF活性44抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡45干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡46atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mutc-Jun、ATF2协同促凋亡constitutivelyactivatec-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡50BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)Chang-DengHuetal.2002,MolCell凋亡时BiFC增多53Fos↑→BiFC↓,Fos↓→BiFC↑Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成54Fos保护神经元5556转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株转录调控研究常用方法4.从源头寻找差异基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.启动子分析：确立启动子核心区预测启动子上的转录因子结合位点6.证明转录因子结合在启动子上：EMSA，ChIP7.蛋白质与蛋白质相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FRET，PLA…