琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

实验二琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的原理掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法实验原理凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA），且检测的范围很广。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能污染。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.水平式凝胶电泳槽2.稳压电泳仪3.电炉4.紫外检测仪5.台式离心机（二）材料实验一中的PCR产物（三）试剂1.琼脂糖2.TAE电泳缓冲液(50×)（pH8.0）Tris242g冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml3.溴化乙锭溶液10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。4.10×DNA样品上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液实验步骤：琼脂糖凝胶制备1.洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。2.插好挡板、梳子。3.根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1×TAE）。4.加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。5.溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4μL(终浓度为0.5g/ml)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。6.室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。7.加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。8.在DNA样品中加入2μL(1/10体积)的10×DNA上样缓冲液(loadingbuffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。12.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。13..根据需要切下DNA条带，放入1.5mlEp管中，放于4℃保存，以备下实验用。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳使用3mg的DNAMarkerDL2,000（500ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法几点注意事项：1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。２.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。３.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。问答题1.影响电泳迁移率的因素有哪些？2.试述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理。复习思考题用多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）回收DNA在高浓度盐离子存在的情况下,DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤去蛋白液和漂洗液将引物,核苷酸,蛋白酶等杂质去除,最后低盐,高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。1．在长波紫外灯下,用干净刀片将所需回收的DNA条带切下,尽量切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。2．将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管,称重。先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次,两次重量相减,得到凝胶的重量。3.加三倍体积溶胶/结合液DB。如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入300μl溶胶液。4．56℃水浴放置5分钟（或直至胶完全溶解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。5．将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）,12,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。6．加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!）,12,000rpm离心1分钟,弃掉废液。7．加入500μl漂洗液WB12,000rpm离心1分钟,弃掉废液。8．将吸附柱AC放回空收集管中,12,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。8.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加25μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好）,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。