液相色谱原理

1液相色谱法的原理浙江省疾病控制中心任一平内容一、液相色谱的原理二、液相色谱的实验三、液相色谱的应用1906‘s-MikhailSemenovichTswett(1872-1919)0NNNNMgCHCH23CH3CH3HC30CH3CH3CH30CH300碳酸钙吸附剂和石油醚1940‘s-分配色谱和纸色谱1950‘s-气相,薄层，凝胶过滤色谱梯度洗脱色谱M.S.Tswett.Ber.Dtsch.Bot.Ges.24:384-393(1906)1960‘s-商业高效液相色谱.历史回顾柱色谱装载样品装载溶剂重力洗脱玻璃柱硅胶氧化铝纤维素糖类粉末滤网1050100150Volume(mL)Time(hr)1.02.03.04.0柱色谱柱色谱进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器高效液相色谱(HPLC)分离InjectorDetectorColumnSolventsMixerPumpsChromatogramStartInjectionmAUtimeHighPerformanceLiquidChromatograph2分离InjectorDetectorColumnSolventsMixerPumpsChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime3分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime4分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime分离InjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime基本概念一、色谱流出曲线和色谱峰二、定性参数三、柱效参数四、相平衡参数五、分离参数一、色谱流出曲线和色谱峰1、色谱流出曲线定义：样品被流动相冲洗，通过色谱柱，流经检测器，所得到信号-洗脱时间曲线2、基线A、噪音：各种未知的偶然因素引起的基线起伏现象。B、漂移：基线随时间朝某一方向的缓慢变化。定义：检测器中只有流动相通过或虽有组分通过而不能为检测器所检出时，所给出的流出曲线称为基线。53、色谱峰定义：流出曲线上的突起部分称为色谱峰W0.05hA+BFs=————=————2A2AFs=0.95–1.05为正常峰，Fs0.95为前延峰，Fs1.05为拖尾峰。二、定性参数2、保留体积保留体积：VR从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时所需流动相的体积。死体积：V0由进样器到检测器出口未被固定相所占的空间。包括：柱体积和柱外体积。调整保留体积：V’R扣除死体积后的保留体积。V’R=VR—V01、保留时间保留时间：tR从进样开始到某一组分的色谱峰顶的时间间隔，即从进样到柱后某一组分出现浓度极大值的时间间隔。死时间：t0不被固定相保留的组分的保留时间。调整保留时间：t’R组分由于溶解于固定相或被吸附等缘故，而比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间。t’R=tR—t0三、柱效参数1、区域宽度:σa、标准偏差：讨论标准正态分布曲线时，将X=±1时的峰宽之半为标准偏差。正常的标准偏差为峰高0.607倍（0.607h）处的峰宽之半。b、半峰宽：Wh/2Wh/2=0.355σc、峰宽:WW=4σ=1.699Wh/22、理论（塔）板数与理论塔板高度取决于固定相的种类、性质、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效的所用物质性质。a、理论塔板数ntRtRtRn=(———)2=5.54(———)2=16(———)2σWh/2Wb、理论塔板高度H：定义为每单位柱长的方差。σ2LH=————=————Lnc、折合塔板高度h：折合塔板高度与固定相粒径（dp）有关因素引起的峰展宽的衡量。Hh=———dp四、相平衡参数1、分配系数K（狭义分配系数）：在一定温度时，达到平衡后，组分在固定相中浓度（Cs）与流动相中的浓度（Cm）之比。CsK=——Cma、分配系数与保留时间的关系：VstR—t0t’RVstR=t0（1+K——）或————=——=K——Vmt0t0Vm分配系数大的组分在色谱柱中停留时间长b、分配系数与保留时间的关系：VsVR=V0（1+K——）Vm2、容量因子：к定义：在达到平衡后，组分在固定相中的量（Ws）与流动相中的量（Wm）。VSK=CC/CM代入CSVSWSк=K———=————=——VMCMVMWMtR=t0（1+к）t’R=t0кK取决于组分、固定相、流动相的性质及温度有关，而与体积VS,Vm无关。而к除与性质及温度有关外，还与体积VS,Vm有关。3、选择性因子：α定义：相邻两组分的分配系数或容量因子之比。K2к2α=———=———K1к16五、分离参数1、分离度R定义：相邻两峰分开的距离与平均峰宽的比值。（tR2–tR1）R=————————（W1+W2）/21___α-1k'R=━━━√n（━━━━）（━━━━━）4αK'+1式中：R-----------用于判断两个组分之间的分辩率。n-----------为理论塔板数。α-----------用于测量柱子分离组分1和组分2的能力。称为分离因子。K’-----------为溶质保留的量度。称为容量因子。以上方程式称之为基本方程式，是液相色谱中控制分离的关键。式中分离因子α，理论塔板数N和容量因子K'是独立的。可通过着三项的变化来控制分离度Rs。基本分离方程式选择性柱效保留值基本方程式的意义1、分离因子α的改变通过流动相和固定相的组成。这一改变主要是通过实验来实现。2、容量因子K'的改变是通过改变流动相的溶剂强度。在反相分配色谱中常使用甲醇和水的不同配比来调节流动相的洗脱强度。又如在正相吸附色谱中，选用正己烷和氯仿的配比来改变洗脱强度。K'值范围大约是：1≤K'≤10，其中最佳值为：2≤K'≤5。3、理论塔板数N的提高靠减小柱子填料的平均粒度，加长柱子和降低流动相的流动速度。增大N值使峰变窄，峰高增大。A、柱子填料的改进。采用了小于10μm的填料进入实用阶段，产生了高效柱子，最高可达80000块板/米以上。目前采用了3μm的球型填料。B、1973年以后由于采用了湿法装柱技术，大大地改善了柱内填料的均匀度。C、在柱子一定的情况下，设法降低H值。其中降低流动相的流速也是一种有效的方法。0.40.50.60.70.81.001.25不同R值的两组分分离R=1.5可以得到基线分离各组份的容量因子（K’）随溶剂洗脱强度的变化增大或缩小增加流动相的洗脱强度，降低了洗脱物的容量因子对于反相色谱，增加10％的有机组成等于降低每个色谱峰的K’值的1/2到2/3。溶剂洗脱强度弱溶剂洗脱强度弱246810110070030010060%AcetonitrileTime(min.)mAU20001600600080%AcetonitrileTime(min.)mAU100040%Water20%Water246810容量因子t0=1=k'k'BAAB23AB12AB12==1.641.58=1.04=1.150.85=1.35=0.950.63=1.50k'k'BAGreaterThan1.2(α)NeedNotBe分离选择性改变流动相的组成改变不同流动相改变流动相pH值改变柱温应用改变固定相特殊的化学效应7不同柱效与选择性的比较柱效低选择性一般柱效低选择性好柱效高选择性差柱效高选择性一般R=1R=1.5R=0.5R=4DetectorResponseInjectTime高柱效低柱效柱效InjecttRWWTimeN=16=5.54HETP=tRW2tR2LN1/2W1/2BB计算柱效塔板数的测定如何改善分离度选择合适的分离参数1、调节流动相的洗脱强度溶剂的种类溶剂的强度变化2、更换色谱柱3、改变分离温度更换流动相的种类8调节流动相的洗脱强度更换色谱柱提高色谱柱的理论塔板数的因素40℃65℃1005温度对分离的影响TimeinMinutes塔板理论色谱过程是物质在相对运动着的两相间连续分配平衡的过程。若两组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速度不等，而实现分离基本假设为：1、色谱柱中存在许多塔板，组分在塔板间快速达到分配平衡。2、样品的组分都加在第0号塔板上，忽略扩散。3、流动相是间歇式进入色谱柱，一次一个塔板体积。4、在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。色谱流出曲线与定量参数C0C=───────eσ×（2π）1/2C0C=───────eσ×（2π）1/2(t-t0)2-───2σ2(V-V0)2-───2σ2色谱峰高：当t=t0时,浓度C为极大值，此值为峰高h色谱峰面积：A=1.065×W1/2×h式中：C为浓度C0为组分的的量σ为标准偏差或9提高理论塔板数的因素1、柱子填充良好2、较长的柱子3、流速较低4、柱填料颗粒较小5、流动相粘度小（可提温）6、样品分子小7、柱外效应小速率方程式的含义H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu涡流扩散+纵向分子扩散（在液相色谱中可忽略不计）+传质速率（流动流动相传质、停滞流动相传质、固定相内传质）=A+Cmu+Csmu+Csu板高曲线初始带宽最终带宽A线速度HETPA=涡流扩散仔细填充柱子使用均一的载体扩散1（涡流扩散）BB=纵向扩散在液相中影响小在低流速中影响大线速度HETPμ扩散2（纵向扩散）扩散3（传质抗阻）滞流的流动相流动相固定相C.u在低流速下可以降低传质阻力使用小颗粒载体可以降低传质阻力HETP线速度C=传质阻力（流动流动相传质+停滞流动相传质+固定相内传质）10总扩散h=A+CuBu.HETPBuC.uA线速度A=涡流扩散B=自由分子扩散C=传质阻力TheVanDeemterEquation+总扩散=涡流扩散+纵向扩散+传质阻抗通过下述方法降低谱带宽度使用均一的载体（填料）仔细填充柱子选择粒度小的载体优化流速或粘度减小进样量降低系统死体积降低输出回路响应时间进样体积vs对峰形的影响手动进样阀-六通