T7-dsRNA合成

T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)一、dsRNA的大量合成1.在室温建立合适的反应体系（室温配制一下反应液）；RiboMAXTMExpressT72×Buffer*10μL正义模板4μL反义模板4μLEnzymeMix，T7Express2μLTotal20μL*冻存的RiboMAXTMExpressT72×Buffer可能含有沉淀，可在37℃温浴中溶解后混匀。注意，试剂中含有亚精胺，在低于室温下可使DNA沉淀。2.轻微混匀，37℃温浴2-6h；（4h）二、残留DNA模板的去除，dsRNA的退火生成，ssRNA的去除3.温浴结束后将反应液于70℃水浴10min，之后缓慢降至室温（~20min）；4.向冷却至室温的反应液中加入1μLRNaseASolution（稀释200倍，1μLRNaseSolution+199μLRNA-freeH2O）和1μLRQ1RNase-FreeDNase，37℃孵育30min；（丢弃稀释后的RNaseSolution，下次不可用）三、双链RNA的纯化5.加入20μL3M醋酸钠，50μL95%的乙醇，冰浴5min；（吸到1.5mL离心管中）6.16000g离心10min，可见离心管底有白色沉淀；7.小心弃去（吸去）上清，用500μL预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清，室温空气干燥15min，加100μLRNA-freeH2O溶解沉淀；8.将产物放在-70℃保存。（取1μL稀释100倍检测浓度，凝胶检测）