DB22T 2083-2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法

ICS65.020B61备案号：42283-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2083—2014食用菌菌种真实性鉴定RAMP法Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP2014-05-04发布2014-06-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20141食用菌菌种真实性鉴定RAMP法1范围本标准规定了利用RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分析步骤、结果记录、分析鉴定的方法。本标准适用于猴头菌（Hericiumerinaceus）、小刺猴头菌（Hericiumcaput-medusae）、珊瑚状猴头菌（HericiumcoralloidesPers）、黑木耳（Auriculariaauricular）和光帽鳞伞（Pholiotanameko）食用菌菌种真实性的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T12728食用菌术语3术语和定义GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1随机扩增微卫星DNA多态性标记RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism（RAMP）是以1条与微卫星序列互补的SSR引物和1条RAPD随机引物相组合，对基因组中的微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段进行随机扩增的技术。3.2菌种真实性VerificationofSpawn供检菌种与对照菌种的符合性4RAMP标记原理采用RAMP标记扩增基因组中微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段，通过比较试样与对照指纹图谱，从而对菌种进行鉴定。5仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20142见附录B。7分析步骤7.1菌丝培养7.1.1培养基的制备称取去皮马铃薯200.0g，制备成均匀碎块（约1cm3），加蒸馏水1000mL，煮沸30min，滤除固体残渣，在马铃薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1.0g，琼脂18.0g，加热使其充分溶解，定容至1000mL，pH自然，装入试管，塞好试管塞。121℃-126℃，高压灭菌30min，摆成斜面冷却后使用。7.1.2接种将供检菌株与对照菌株在相同条件下培养，培养量可供做3个平行鉴定试验。将待供检菌株与对照菌株在无菌条件下，切取（3～5）mm×（3～5）mm大小一块母种，迅速转移至试管斜面培养基中央位置，每个菌株接种20支～30支试管。7.1.3恒温培养将接种后的试管置恒温培养箱中，分别在25℃条件下避光培养黑木耳9d～12d，猴头菌、小刺猴头菌、珊瑚状猴头菌培养12d～15d；在20℃条件下避光培养光帽鳞伞15d～20d。7.2DNA提取7.2.1称取0.1g的菌丝置于无菌研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；7.2.2将菌丝粉末迅速转移至1.5mL离心管中，加入600µL的65℃预热的CTABDNA提取缓冲液，置于65℃水浴45～60min，每5min～15min颠倒混匀；7.2.3加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min；7.2.4取上清加等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min，重复7.2.4抽提1次；7.2.5加等体积异丙醇-20℃充分沉淀；7.2.64℃，5000rpm离心10min，弃上清；7.2.7加500µL的70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加40µL的TE缓冲液（pH8.0）溶解；7.2.8加入10mg/mL的RNase溶液至终浓度达50μg/mL，去除RNA，37℃水浴1h；7.2.9重复操作7.2.3～7.2.5，加入100μLTE缓冲液（pH8.0），使DNA充分溶解，并置于4℃冰箱中保存备用注：长期保存应采用-20℃；多次测定需分装保存，每次使用后不再重新冻存。7.3DNA纯度检测7.3.1电泳检测取1%琼脂糖溶液40mL加入4µL的溴化乙锭，缓慢倒入凝胶托盘中冷却，避免出现气泡，插入梳子，待胶体凝固后，缓慢拔出梳子，将凝胶托盘置于装有1×TAE缓冲液的水平电泳槽中；在凝胶点样孔中加入5µL菌株DNA提取液与2µL的6×Loadingbuffer的混合液体，用5µL的λHindⅢMarker作为参照；采用100V恒压电泳，待溴酚蓝前沿指示剂移动到距凝胶前沿0.5cm～1cm处，停止电泳本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20143（约1h）；在凝胶成像系统中观察并照相；电泳条带应呈现单一清晰状态，否则重新提取DNA。7.3.2紫外检测取3µLDNA提取液，用无菌水稀释至一定倍数，混匀后，加入石英比色皿中，加入量为比色皿体积的3/4，并以无菌水或TE缓冲液为空白对照，用紫外-可见分光光度计分别在260nm和280nm下测量其OD值，计算OD260/OD280比值，如果该比值在1.6~1.8之间，可以进行PCR反应，否则重新提取DNA。待测样品含量（µg/mL）=OD260值×稀释倍数×507.4PCR扩增7.4.1RAMP引物及其使用由4条SSR引物和10条RAPD引物组成40对核心引物。使用时首先选用5对参见附录C（按菌种分类引物）。如果没有得到好的结果，则选用其他组合。7.4.2PCR反应体系25µL的反应体积，含ddH2O为3.25µL，10×PCR缓冲液为2.50µL，2.5mmol/LdNTPs为2.00µL，10µmol/LPrimer1为1.00µL，10µmol/LPrimer2为1.00µL，5U/µLTaqDNA聚合酶为0.25µL，5ng/µLDNA模板为15.00µL。7.4.3PCR反应程序设置空白对照。94℃预变性2min，1个循环；94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，共45个循环；72℃延伸10min，4℃保存。7.5PCR产物电泳检测参见7.3.1方法。配制2%琼脂糖凝胶，在点样孔中加入5µL的菌株PCR产物与2µL的6×Loadingbuffer的混合液体，取DL2000Marker和150bpMarker各3µL混合后作为参照。8结果判定电泳结束，将凝胶置于凝胶成像仪或紫外透射仪观察，照相保留实验结果。如果三个平行结果一致，实验结果可以使用。供检菌株与对照菌株差异明显，判定供检菌株与对照菌株不属于同一菌种或同一品种，如只出现一对引物差异，则判定为近似菌种或近似品种。供检菌株与对照菌株之间的谱带未检测出差异，再选定5个引物做进一步验证试验。必要时可增加其他方法佐证。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20144AA附录A（规范性附录）主要仪器设备及试剂A.1主要仪器设备A.1.1PCR扩增仪；A.1.2紫外-可见分光光度计；A.1.3凝胶成像系统或紫外透射仪；A.1.4冷冻离心机（能离心0.2～1.5mL离心管，转速在1×104rpm以上）；A.1.5高压灭菌装置（可以达到温度121.3℃，压力0.15MPa）；A.1.6超净工作台；A.1.7分析天平（感量0.0001g）；A.1.8微量移液器：规格分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调；A.1.9酸度计；A.1.10恒温培养箱；A.1.11冰箱：最低温度-20℃；A.1.12水浴锅或金属浴：控温精度±1℃A.1.13电泳仪（具有稳流4～400mA连续可调和稳压5～500V连续可调）；A.1.14水平电泳槽及配套的制胶附件；A.1.15照相系统。A.2主要试剂A.2.1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）；A.2.2聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)A.2.3溴酚蓝A.2.4乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）；A.2.5三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）；A.2.6β-巯基乙醇A.2.7苯酚A.2.8三氯甲烷；A.2.9异丙醇：（2-丙醇;二甲基甲醇;C3H8O；CASRN:67-63-0）A.2.10异戊醇；A.2.11盐酸；A.2.12氢氧化钠（NaOH）；A.2.13氯化钠；A.2.1410×Buffer缓冲液：含Mg2+25mmol/L；A.2.15四种脱氧核苷三磷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10mmol/Leach）；A.2.16TaqDNA聚合酶：2U/μL；A.2.17琼脂糖；本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20145A.2.18DNA分子量标准：DL2000；A.2.19核酸染色剂；按说明使用。（警告——使用本试剂的人员应有正规实验室的工作经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。）A.2.20甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）；A.2.21丙烯酰胺（acrylamide）；A.2.22无水乙醇；A.2.23四甲基乙二胺（TEMED）；A.2.24过硫酸铵（APS）；A.2.25冰醋酸；A.2.26DNA分子量标准本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20146BB附录B（规范性附录）试剂的配制除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。B.1溴酚蓝前沿指示剂加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解（溴酚蓝其钠盐易溶解在水里）。B.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液称取Tris121.1g，加去离子水溶解，冷却至室温后用浓HCl溶液调节溶液的pH至8.0(约42mL)，定容至1000mL，高压灭菌。B.310mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠80g，用去离子水溶解后，定容至200mL。B.40.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液称取二水乙二胺四乙酸二钠186.1g，加去离子水700mL完全溶解（加热）后，冷却至室温，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0，加去离子水定容至1000mL，高压灭菌。B.5CTABDNA提取缓冲液1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)4mL，5mol/LNaCl56mL,1-2gCTAB，1gPVP-40，65℃水浴溶解，定容至100mL，高压灭菌。使用前加入0.1%的β-巯基乙醇。B.6TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液10mL和0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液2mL，加水定容至1000mL，分装高压灭菌。B.750×TAE缓冲液称取Tris242.2g，量取冰醋酸57.2mL，加水溶解后，再加入0.5mol/L乙二胺四乙酸（pH8.0）溶液100mL，加水定容至1000mL。使用时稀释50倍。B.81%琼脂糖溶液本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2083—20147称取0.4g琼脂糖于三角瓶中，加入40mL的1×TAE缓冲液