原位杂交_生物信息分析等生物技术

生物信息学流感先心病组—唐超2010年12月19应用生物信息学解决科研问题的常规思路•1思考所要分析的内容•2查找能够解决此类问题的软件或者网站•3熟悉软件和网站的使用•4通过对比分析,在多款软件和网站中得出你所需要的软件或者网站•5运用该软件或者网站解决科研问题NCBI：NationalCenterforBiotechnologyInformation•NCBI(美国国立生物技术信息中心)理解自然无声但精妙的关于生命细胞的语言是现代分子生物学的要求。通过只有四个字母来代表DNA化学亚基的字母表，出现了生命过程的语法，其最复杂形式就是人类。阐明和使用这些字母来组成新的“单词和短语”是分子生物学领域的中心焦点。数目巨大的分子数据和这些数据的隐秘而精细的模式使得计算机化的数据库和分析方法成为绝对的必须。挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性，并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具，以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解。一、查找并下载文献二、查找目的基因三、根据目的基因设计引物四、测序后序列对比关于可查找各种信号通路图的３个国外网站•://://蛋白质功能分析及预测结构域分析Smart亚细胞定位预测：磷酸化位点预测：跨膜区预测：分子量等电点预测：信号肽预测：二级结构预测：网站和软件推荐•在线引物设计•丁香园•中国医学生物信息网•生物谷•中生网•生物通原位杂交•原理：•原位杂交（insituhybridization）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有的位置进行细胞定位。应用原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Genemapping),转基因检测,基因表达定位、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics)产前诊断、肿瘤和传染性疾病的诊断生物学剂量测定(biologicaldosimetry)和病毒学的病原学诊断等。进行整体原位杂交的优点：整体原位杂交具有易操作、周期短、整体效果明显等特点，是一种较新的组织原位杂交方法。胚胎是个体发育的最初阶段，整体原位杂交作为检测胚胎发育过程中基因表达整体效果的快速、有效手段，已在果蝇，小鼠，线虫，斑马鱼，鸡等少数几种动物中应用。小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置10XPBS(1liter):80gNaCl、2gKCl、14.4gNa2PO4、2.4gKH2PO4(adjusttopH7.4withHClandbringto1literwithwater)PBT:1XPBSplus0.1%or1%Tween-20NOTE:Formouseembryos,itisrecommendedthatallsolutionswithTweencontain1%,ratherthan0.1%.Tweenisroutinelyusedat0.1%inhechickprotocol.Hybridizationsolution:50%formamide，5XSSC,pH4.5，1%SDS50mg/mlyeasttRNA50mg/mlheparinSolutionI:50%formamide5XSSC,pH4.5，1%SDSSolutionII:0.5MNaCl,10mMTris-HCl,0.1%Tween-20SolutionII加RNaseA.目的是消化未杂交上的ＲＮＡ.SolutionIII:50%formamide2XSSC,pH4.5Sheepserum:inactivatebyheatingto70°Cfor30minutes,storeinaliquotsat-20°C.10XTBS(for1liter):80gNaCl、2gKCl、250ml1MTris-HCl,pH7.5小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置TBST:1XTBSplus0.1/1%Tween-20、2mM(0.5mg/ml)Levamisole(左旋咪唑)NTMT:100mMNaCl、100mMTris-HCl,pH9.550mMMgCl20.1/1%Tween-202mM(0.5mg/ml)Levamisole左旋咪唑200XNBT:50mg/mlNBTin70%DMF200XBCIP:25mg/mlBCIPinwater要临时配制的试剂有：PBT,6%的过氧化氢，2毫克/毫升的甘氨酸溶液，4%paraformaldehyde和0.2%glutaraldehyde，TBST，封闭溶液（用TBST配制而成的10%的热灭活的羊血清另加0.1%的封闭剂，抗体的稀释（用2%的封闭剂/TBST稀释，每次漂洗约1.7毫升），10%的封闭剂用TBST配制。同位素生物素荧光素地高辛标记方法P32标记标记在dATP上，通过PCR法掺和到探针中用荧光色素来标记，如异硫氰酸荧光素，罗达明等标记在UTP上，通过PCR法掺和到探针中优点便宜无污染，可以在-20度长期保存简单，特异性好对人体无害，易检测，敏感性好，可以在-20度长期保存缺点污染环境，对人体有害受半衰期限制，检测周期长灵敏度不是很高受时间的限制昂贵检测方法放射自显影与抗生素蛋白(avidin)结合在荧光显微镜下观察带有碱性磷酸酶标记的dig抗体检测，最后通过显色剂显色。一探针载体的构建1.选择目的基因的探针片断2.设计引物3.PCR4.连接PGEMT载体及转化5.PCR检测或酶切检测6.测序7.载体构建成功二RNA探针的合成1反应混合物的主要组成：2合成条件：含有目的片段的线性化载体，线性化载体浓度最好达到０.２－１.０微克／微升.SP6聚合酶，T7聚合酶，地高辛标记的NTP，RNA酶抑制剂等。37度反应1-2小时，反应时间的延长并不能增加RNA的量。注意：SP6聚合酶在40度的条件下活性最好，因此也可以在该温度下进行合成。理想的RNA,OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解胚胎从小鼠体内取出来之后1、在新鲜的用PBS配置的4%的多聚甲醛（PH=7.4）中于4°C固定过夜。2、将胚胎放在PBT中洗5分钟，室温慢慢摇晃3、在用PBT配置而成的25%,50%,75%，100%的甲醇溶液梯度中脱水每次5分钟，室温慢慢摇晃（胚胎大一点可适当延长时间）4、100%的甲醇-20度保存。（最多保存6个月）小鼠胚胎发育过程9.5天小鼠胚胎6.5天的小鼠胚胎7.5天的小鼠胚胎10天小鼠胚胎11.5天小鼠胚胎15.5天小鼠胚胎13.5天小鼠胚胎12天小鼠胚胎原位杂交现在开始了在75%,50%,25%用PBT配置的甲醇中进行梯度复水，每次5分钟PBT中洗两次每次5分钟6%的过氧化氢漂白至少1个小时(10.0D-14.0D胚胎一般处理2H;6.5D-9.5D一般1.0H够了.)在PBT中洗3次，每次5分钟蛋白酶K处理37度15-20分钟（酶的浓度及时间随具体情况而定，小鼠胚胎一般是10ug/ml）6.5dpc:4min7.5dpc:4-5min8.5dpc:6min9.5dpc:10min10.5dpc:15min11.5-14.0:30min用2mg/ml的甘氨酸溶液处理10分钟终止蛋白酶K的反应以防止消化过度PBT中洗两次，每次5分钟用PBT配置的4%多聚甲醛和0.2%的戊二醛重新固定20分钟PBT中洗两次，每次5分钟在1:1的杂交液:PBT中洗10分钟在杂交液中洗10分钟70度杂交液中温育至少1小时加了探针的杂交液70度温育过夜探针浓度为0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）70度预热溶液I用溶液I在70度洗胚胎三次，每次30分钟65度预热溶液III用溶液III在65度洗胚胎三次，每次30分钟用TBST洗胚胎三次，每次5分钟加入10%的羊血清及0.1%的封闭剂2-4小时室温溶液II洗3次/5min加RnaseA的溶液II洗2次/30min抗体孵育：抗地高辛抗体/封闭液以1：3000比例4℃孵育胚胎过夜。室温在NTMT中洗三次，每次至少10分钟移去NTMT，加入显色剂NBT,BCIP在室温下慢慢摇动，直到显出合适的颜色为止用PBT清洗几次，终止显色反应4%多聚甲醛和0.2%的戊二醛重新固定用PBS清洗三次(每次10min)以终止显色，体式镜下拍照。也可将胚胎用甲醇/PBST溶液剃度脱水后保存于-20℃甲醇中。0.05MPBS洗15min×4次染色质免疫共沉淀（CHIP）•原理：是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。应用•1、CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用•2、可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系•3、CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：•CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。•CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点•RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。一般ChIP的流程：•甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。将染色质切成小段通过特异性抗体检测组蛋白和非组蛋白与基因组相互的作用洗脱分析基因组PCR和基因图谱分析取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％37摄氏度孵育10min。终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm5min收集细胞。倒去上清。按照细胞量，加入SDSLysisBuffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。第一天细胞的甲醛交联与超声破碎除杂及抗体哺育超声破碎结束后，10，000g4oC离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于-80oC。300ul中，