药物遗传毒性研究技术指导原则-201704(征求意见稿)

1药物遗传毒性研究技术指导原则（征求意见稿）2药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用），染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也因同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使3用人群的用药风险方面发挥重要作用。本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。二、基本原则（一）实验管理要求药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP），并在通过GLP认证的实验室进行。（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面的分析评价。（三）随机、对照、重复遗传毒性试验应符合毒理学试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。三、基本内容（一）受试物受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量4和安全性的样品。（二）标准试验组合对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价，遗传毒性试验可用于检测体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物质的试验，也可在整体动物上进行体内试验；根据试验检测的遗传终点，可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤；根据试验系统，可分为体内试验和体外试验。遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所有的与肿瘤发生相关的遗传毒性机制，因此，通常采用体外和体内试验组合的方法，以全面评估受试物的遗传毒性风险。这些试验相互补充，对结果的判断应综合考虑。1、标准试验组合应具备的特征标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，从原核到真核细胞，应包含以下内容：（1）应包含细菌回复突变试验。因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的遗传毒性致癌剂。（2）应包含哺乳动物细胞体外和/或体内试验。哺乳动物体外试验中，体外中期相染色体畸变试验、体外微核试验、小鼠淋巴瘤L5178Y细胞tk基因突变试验（简称小鼠淋巴瘤细胞试验，MLA）已经过充分验证并被广泛应用。若实验室对这些方法5已进行了充分的验证，当用于标准试验组合中时，这几个试验在检测染色体损伤时可互相替换。体内试验具有考虑到如吸收、分布、代谢、排泄等因素的优势，并且可检出体外试验无法检出的某些遗传毒性物质（注释1），因此标准试验组合中应至少包含一项体内试验。可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤体内试验或其他合适的体内试验。啮齿类动物染色体损伤体内试验包括骨髓或外周血红细胞微核试验和骨髓中期相细胞染色体畸变试验。2、推荐的两种标准试验组合组合一：（1）一项细菌回复突变试验；（2）一项染色体损伤的体外细胞遗传学试验（体外中期相染色体畸变试验或体外微核试验），或一项体外小鼠淋巴瘤tk基因突变试验；（3）一项体内遗传毒性试验，通常为采用啮齿类动物造血细胞进行的染色体损伤试验，用于检测微核或中期相细胞染色体畸变。组合二：（1）一项体外细菌回复突变试验；（2）采用两种不同组织进行的体内遗传毒性试验，通常是一项啮齿类动物造血细胞微核试验及第二项体内试验。以上两种试验组合同等适合（注释2），可根据受试物特点自主选择。6体内试验可采用单次给药或重复给药的试验设计。如果试验设计科学合理，采用重复给药时可将遗传毒性终点指标整合入一般毒性试验中；当在体内评价一项以上的遗传毒性终点指标时，也可将它们合并在一项试验中。但是，整合的前提条件是试验设计（例如剂量、采样）对于重复给药试验是合适的，并且需要获得充分的支持信息。完成上述任何一种标准试验组合，若试验结果为阴性，通常可提示受试物缺乏遗传毒性。对于标准试验组合得到阳性结果的受试物，根据其治疗用途，可能需要进一步的试验。标准试验组合不包含为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，检测中期相细胞染色体畸变的体外和体内试验可检测多种类型的染色体完整性方面的改变，微核试验具有检测某些非整倍体诱导剂的能力，小鼠淋巴瘤细胞试验也可检测染色体丢失（可能导致非整倍体）。建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，用作对标准试验组合得到的遗传毒性试验结果的进一步研究。在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对受试物不适合或因技术原因无法实施时，可采用其他经过验证的试验作为替代试验，但应提供充分的科学合理性及依据。附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，具体试验时需根据具体情况具体分析，设计合适的试验方法。3、标准试验组合的调整7标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。（1）当受试物对细菌有高毒性时（如某些抗生素），仍应进行细菌回复突变试验，因为致突变性可能发生于较低、毒性较小的浓度。此外，还应进行一项体外哺乳动物细胞试验，即采用试验标准组合一。（2）标准试验组合通常可检出具有遗传毒性作用的可疑结构的受试物（注释3），因为大部分“可疑结构”被定义为与细菌诱变性有关。但是，对于具有某些特殊可疑结构的化合物，需要对标准组合方案进行调整（注释4）。附加试验的选择或方案的调整取决于这些可疑结构化合物的化学性质、已知活性和代谢信息。（3）某些特殊的受试物，如毒代或药代动力学研究提示其不被全身吸收，因此在体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释5），如放射影像剂、抗酸铝合剂、一些吸入用药和一些皮肤或其他局部用药。对这些受试物，体内试验难以提供有用的信息。在改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露时，以及对暴露量最高的组织无合适的遗传毒性试验的情况下，仅根据体外试验进行评价可能是合适的。某些情况下，在接触部位评价遗传毒性作用可能也是合理的，虽然这些试验还未被广泛应用（注释6）。4、生殖细胞诱变剂的检测遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。标准试验组合中不包含专门检测生殖细胞诱变剂的试验。但是，有关生殖细胞诱变剂检测的比较研究结果显示，从定性的角度，大多数生殖细胞诱变剂能在体细8胞试验中检出，因此体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对生殖细胞无影响。体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。（三）体外、体内试验基本要求遗传毒性的体内外试验方法较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，具体试验时需根据具体情况具体分析。无论对于体外、体内试验，方法学均应经过充分验证。应进行各实验室历史背景对照数据库（包括阴性和阳性对照数据库）的建立。对于已建立的试验方法，若试验方案发生改变，需建立新的历史对照数据库。1、体外试验基本要求1．1细菌回复突变试验中采用的基本菌株细菌回复突变试验至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/TA97a），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换或移码突变以及检测交联剂的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）。1．2体外试验中最高浓度的确定（注释7）体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。91．2．1最高浓度对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物，细菌回复突变试验应达到的最高浓度为5mg/皿（液体受试物为5µl/皿），哺乳动物细胞试验为1mM或0.5mg/ml（选用较低者）。1．2．2要求达到的细胞毒性水平在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又可影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。当哺乳类动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性（如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果）会导致遗传毒性假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳类动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平（浓度不应超过1.2.1中的规定）：（1）在细菌回复突变试验中，进行评价的浓度应能显示明显的毒性，如回复突变菌落数目减少、背景菌苔减少或消失。（2）哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，最高浓度产生的细胞毒性应不超过细胞生长减少约50%，可通过评价相对群体倍增数（RelativePopulationDoubling，RPD）和相对细胞增长数（RelativeIncreaseinCellCount，RICC）来反映细胞毒性；对培养的淋巴细胞，增殖抑制率应不高于约50%。（3）对于小鼠淋巴瘤细胞试验，最高浓度应能产生80%~90%细胞毒性，即相对总细胞生长率（RelativeTotalGrowth，RTG）为1020%~10%。1．2．3难溶受试物的检测在用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。建议采用以下策略检测相对不溶的受试物。（1）对于细菌回复突变试验，如果沉淀不干扰计数，应对产生沉淀的浓度进行计数，且最高浓度不超过5mg/皿。当未观察到细菌毒性时，应以产生沉淀的最低浓度作为计数的最高浓度；当观察到剂量相关的细菌毒性或诱变性时，应按上述细胞毒性的要求来确定最高浓度。（2）对于哺乳动物细胞试验，若沉淀不干扰计数，最高浓度应是培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度。应通过肉眼观察或光镜检查等方法来观察记录培养过程中沉淀是持续存在或培养过程中出现（至处理结束时）。1．3体外试验的重现性体外试验应关注重现性。当采用新方法或试验出现非预期结果时，有必要进行重复试验。但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有效的内部质量控制，可不必进行重复试验，例如：对哺乳动物细胞基因突变试验，进行了规范的范围确定试验，其可提供足够的数据以保证试验方法的正确性；对体外染色体损伤的细胞遗传学试验、体外微核试验和小鼠淋巴瘤细胞试验，采用了合适的、规范的方法，如包括有阳性和阴性11对照、加和不加代谢活化的试验、处理时间及采样时间合适等。在进行这些试验后，若得到明确的阳性或阴性结果，通常不需要重复试验；但是，若得到可疑结果，则需要进一步试验。2、体内试验基本要求2．1检测染色体损伤的体内试验采用骨髓细胞分析染色体畸变或检测含微核的嗜多染红细胞的体内方法均可用于检测染色体断裂剂。如果产生了一