动物防御素研究进展

防御素的研究进展王天航,刘汉林,谷兴光（北京联合大学生物化学工程学院，北京100023）摘要:防御素(defensins)是一类富含半胱氨酸和精氨酸的阳离子低分子内源性抗微生物短肽,主要以颗粒形式存在于吞噬细胞(粒细胞和巨噬细胞)和位于小肠隐窝的分泌细胞-潘氏细胞的细胞器内,具有广泛的杀菌活性、细胞毒性和免疫趋化作用,是机体天然免疫系统的重要组成部分,本文介绍了防御素的种类、基本结构、作用机理，并阐述了其应用。关键词:防御素;种类；基本结构;作用机制;应用1前言：抗菌肽是自然界中各类生物都具有其内在的防御系统,当机体受到外界微生物侵染时,该系统便会产生一类防御性的肽类活性物质。防御素不同于其他的抗菌肽，一般抗菌肽作用于病原体的酶但防御素是直接作用于病原体的细胞膜,因此靶细胞不会对其产生抗性。所以防御素具有高效、广谱抗菌作用,且不会像抗生素那样产生抗药性和毒副作用,因此防御素具有很大的药用价值,同时防御素也可以作为免疫调节剂来调节机体的免疫系统。因此对防御素的研究非常有意义。2防御素的分类与基本结构[1]防御素是1种小的阳离子肽,是天然宿主识别微生物的基础。截止目前研究发现防御素的种类有:哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素,而在哺乳动物体内又发现3种防御素亚家族,即α-防御素、β-防御素和θ-防御素。2.1哺乳动物类防御素防御素是动物体内防御系统的主要成分,大多由29个～42个氨基酸残基组成,含3对分子内二硫键,相对分子质量为2ku～6ku,根据其二硫键位置的不同可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素3类。α-防御素是于1980年美国Lehrer实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到的、阳离子性极强的小分子抗菌肽,称为defensin,后被归为α-防御素;主要分布于人类、兔子、猪、鼠类的嗜中性粒细胞、兔子的齿槽巨嗜细胞及人类和啮齿动物的小肠潘氏细胞。α-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。其中Cys1-Cys6连接N端和C端,形成分子大环。β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的,后又在牛粒性白细胞中发现了13种与其序列高度相似,但其共有序与α-防御素不同,故被命名为β-防御素;主要分布于牛的骨髓和人及多种动物(牛、羊、猪、骆驼、驯鹿、小鼠、大鼠)的胃肠道、呼吸道、舌、牙龈、肾、皮肤的上皮中[2-3],近来在梅花鹿的舌粘膜的上皮细胞内也发现了该短肽。单核细胞和巨噬细胞通常缺乏防御素,但是他们可以释放诱导上皮细胞合成β-防御素的信使。β-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。θ-防御素是于2002年Trabi等用反向高效液相层析色谱法从猕猴的白细胞中分离出来的1种成环状结构分子,又被称为猕猴θ型防御素-1(RTD-1),主要分布于巨嗜细胞内。θ-防御素的结构不同于α和β-防御素,其前体(已经发现3种)是α-防御素类似物,由1个终止密码子从α-防御素3个半胱氨酸碳骨架的第4个残基处截断,从截短的α-防御素前体切掉1个9个氨基酸的片段,然后从头到尾进行剪切,直到其他的相同或相似的九肽出现。成熟的θ-防御素是2个半防御素的修饰与结合的产物,它的前体(称之为半防御素)是变异的α-防御素基因和1个未成熟的终止密码子的编码产物,导致每1个前体仅仅包含3个半胱氨酸残基。θ-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6,连接形成环状结构。2.2昆虫类防御素[4]在1988年由Masturyama在1种半翅目昆虫肉蝇中发现了第1种昆虫防御素。后来Dimarcq等先从果蝇中分离到1种病原菌诱导的抗菌肽,发现果蝇的防御素基因是单拷贝且无内含子,据此推测昆虫的防御素是独立进化而来的。后来经研究发现,昆虫防御素与哺乳动物防御素在二硫键的连接方式以及三维空间构型上是截然不同的,从而证明了昆虫防御素和哺乳动物防御素不具同源性。绝大多数昆虫的防御素带1个净正电荷,分子量为4.0ku左右,由34个～51个氨基酸组成,氨基酸序列中都含有6个保守半胱氨酸,3个分子内二硫键形成β片装结构和1个α螺旋结构,二硫键以Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6连接。2.3植物类防御素在1990年由Mendez等从小麦、大麦种子首先分离得到植物防御素r1-P和r1-H,用NMR光谱法测定其三维结构,发现与哺乳动物和昆虫防御素相似。最近Thevissen也通过比较植物和昆虫防御素与真菌的葡糖苷鞘氨醇的相互作用,得知它们是由同一个前体细胞祖先进化而来的。植物防御素的分子质量小于5ku,由45个～54个氨基酸组成,3个分子内二硫键形成1个反向的β片装结构和1个α螺旋结构,含有4对二硫键且连接方式为Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6、Cys4-Cys7。3防御素的作用机制[5]对于防御素抗菌活性机制,大部分研究者认为主要和微生物的细胞膜结构有关。防御素发挥抗菌作用可分为三个阶段:(1)由静电吸引,防御素与靶细胞膜结合。防御素带正电荷,可通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合;(2)通道形成。带正电荷的防御素分子或其多聚体则与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用,显著地增加生物膜的通透性。防御素作用与膜上形成稳定的多个通道;(3)内容物外泄。通道形成后,防御素进入细胞内的同时,其他胞外分子也伴随进入(如肽、蛋白质或无机离子),而靶细胞的重要物质(如盐离子和大分子)渗出,致使靶细胞发生不可逆损伤而死亡。防御素还能通过诱导细胞因子的释放和介导非成熟性的树突状细胞协同刺激分子的表达上调,促进IDC的成熟,进而活化T细胞,触发特异性免疫应答。另外,由于大多数真菌、支原体、螺旋体等致病微生物的胞膜也和细菌一样带负电荷,所以也是防御素的攻击对象,而高等动物的细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免受攻击。此外,还发现防御素抗革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的机制存在差异。可能原因有:(1)革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞膜构成不同。革兰氏阴性菌细胞膜上含有较多的脂多糖,其带有很强的负电荷;而革兰氏阳性菌的细胞膜上含有较多的磷壁酸,其带有较多的负电荷。因而,带有正电荷的防御素会更加容易通过静电吸引与革兰氏阴性菌结合。有研究发现防御素是通过阳离子精氨酸侧链与细菌膜结构中的阴离子通过静电吸引相结合,随后在细胞膜电动势的驱动下,防御素插入细胞膜,在膜上形成多聚体,共同构成膜活性物质;接着膜活性物质在细胞膜结构中形成若干通道,通道融合破坏胞膜完整性,那些正常情况下不能出入细胞的物质会内渗或流出,最终导致细菌崩解死亡；（2）革兰氏阳性菌细胞膜肽聚糖较厚,防御素在其表面形成孔道相对比在革兰氏阴性菌上形成孔道难,需要时间长,因而防御素对革兰氏阳性菌表现的杀菌活性相对较弱。4防御素的应用4.1在医学中的应用4.1.1防御素与口腔黏膜疾病的关系[6]作为机体天然免疫的重要组成部分，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用，与多种口腔黏膜疾病（口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等）关系密切。现今关于这方面的研究尚处于起步阶段.4.1.2防御素与慢性阻塞性肺部疾病的关系慢性阻塞性肺部疾病（COPD）是一种以气道受限为特征的慢性气道炎症性疾病，患病率及病死率均较高，其中呼吸道感染是COPD发病及加剧的一个重要因素HBD-2与呼吸系统疾病关系紧密，在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究证实，HBD-2的产生或作用被抑制后，机体将发生肺部感染，据此推测人为补充外源性防御素可能会阻止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实，重组HBD-2对肺损伤具有保护作用，可减少绿脓杆菌感染大鼠肺组织的菌落数[7]。COPD患者存在气道、肺实质和肺血管炎症，而肺上皮细胞中高表达的HBD-2能通过对肺部炎症因子的调节，阻止全身性炎症反应(SIRS)甚至多器官功能衰竭（MODS）的发生发展。此外，重组HBD-2还可调控脓毒症诱发的肺组织细胞的过度凋亡，从而减轻肺组织损伤，保护肺功能[8]。4.1.3防御素的临床药用研究防御素抗菌谱广泛，作用机理特殊，微生物不宜产生抗药性，因此具有很大的药用潜力。目前已进入临床试验阶段的防御素主要有细菌素、源于蛙马盖宁的MSI-78及源于猪protegrin的IB-367。对926例患者局部感染治疗的临床试验结果显示，MSI-78对糖尿病患者足溃疡的疗效显著，且副作用较小；在系统感染治疗中，人中性粒细胞抗菌蛋白衍生物BPI作为一种注射药物已进入临床III期试验，结果显示其对脑膜炎奈瑟球菌的疗效显著[9]。4.2在食品中的应用防御素具有良好的热稳定性，作为食品防腐剂可用于热加工食品的防腐保鲜，此外，它还可被用于防止巴氏杀菌后的再污染。4.3在畜牧业中的应用抗生素添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生态平衡，药物残留也影响了畜产品的品质和人类健康，而来源于哺乳动物的防御素相对分子质量较小，热稳定性和水溶性均较好，在肠道内几乎不被吸收，仅在消化道内发挥作用，动物采食后在体内一般无残留。利用基因工程方法生产环保型防御素饲料添加剂或通过日粮添加，都可调控防御素基因的表达并实现其功效。通过对动物防御素基因等位变异和表达的分析，育种学家试图将防御素基因作为抗病育种的候选基因，从而选择对乳房炎等疫病具有高抗性的品系或群体。Swanson等研究发现牛乳中的体细胞数和牛舌黏膜上皮细胞中舌抗菌肽（LAP）的表达呈正相关；原位杂交实验也表明舌抗菌肽mRNA可在乳腺上皮组织中表达。这预示着舌抗菌肽参与了乳房炎的先天性免疫，为奶牛乳房炎的预防和治疗提供了重要依据。4.4在农业中的应用防御素在农业中可用于农作物抗病育种研究，该研究主要是寄希望建立防御素生物反应器，大量生产并提纯防御素蛋白，以便培育抗性新品种。已有研究者将兔防御素NP-1转入小麦植株，田间抗病虫鉴定结果显示小麦对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性均有较大提高[10]。而将兔防御素NP-1基因构建至植物表达载体中获得转基因番茄植株的抗病实验结果表明，其对番茄青枯病具有抗性，为番茄的抗病育种工作奠定了基础[11]参考文献[1]冯艳.防御素的结构特点及抗肿瘤机制研究进展[J].肿瘤预防与疗,2008,21(4):466-469.[2]杨银凤,唐博.β-防御素caBD-1mRNA在骆驼组织器官中的表达[J].中国兽医科技,2004,11(34):3-6.[3]吴萨日娜,赵艳芳,杨银凤.驯鹿β-防御素-1(reBD-1)mRNA在驯鹿组织器官中的表达检测[J].中国草食动物,2006,26(6):23-25.[4]李涛,杨银凤.防御素的研究进展[J].内蒙古农业大学学报,2009,30(1):321-324.[5]高小艳,刘顺德,王长法,何洪彬.动物防御素研究进展[J].家畜生态学报，2010,31(3):80-83.[6]张维琼,吴巧英,汪国华.防御素在口腔疾病中的研究进展[J].现代口腔医学杂志,2009,23(4):426-430.[7]王海宏,舒强,石卓,等.重组β-防御素-2对呼吸道绿脓杆菌感染大鼠急性肺损伤的保护作用[J].中华麻醉学杂志,2005,25(10):762-764.[8]徐笑益,石卓,鲍军明,等.重组β-防御素-2多肽对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响[J].浙江大学学报(医学版),2006,35(6):600-604.[9]邱晓燕.抗菌肽的免疫功能和应用前景[J].生物学通报,2002,37(1):24-25.[10]周春江,黄占景,沈银柱,等.兔防御素NP-1基因在小麦抗病育种中应用的初步研究[J].麦类作物学报,2003,23(2):7-10.