细胞生物学常用研究方法

Southern杂交:是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。RNAi技术:是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。Northern印迹杂交（Northernblot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。分子杂交技术:具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（insituhybridization）。用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。蛋白质印迹法：即WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。GFP（绿色荧光蛋白）的应用：用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。负染技术:用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。细胞融合技术：所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cellfusion)或细胞杂交(cellhybridization)免疫共沉淀：用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。免疫电镜技术：是利用电子显微镜在超微结构水平上研究免疫反应的一项的新技术。用电子致密物质如铁蛋白等标记抗体，然后让其与含有相应抗原的生物标本反应，从电镜观察可见电子致密物质的所在位置，识别抗原、抗体反应的部位。由于电子显微镜的分辨力很高，故可准确地显示抗原所在部位。该技术是一种在分子水平上的抗原定位法，实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的原理应用到分子水平上。此项技术在细胞抗原成分的定位、识别以及细胞形态和功能关系的研究上，已成为重要的方法。主要用于病毒、细菌等抗原定位、免疫性疾病的发病机理及超微结构免疫细胞化学研究等。冰冻蚀刻freeze-etching:亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。BrdUincorporation：阿糖胞苷（Ara-C）对人肺腺癌细胞株A549的凋亡诱导作用及其机制。方法Ara—C体外作用于／t549细胞，噻唑蓝还原法（MTT法）检测Ara—C对A549细胞增殖的抑制作用；Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态学的变化；单细胞凝胶电泳技术（cometassay）测定A549细胞DNA的损伤程度；以Westernblotting进一步证明A549细胞发生凋亡。结果Ara-C对A549细胞的增殖有明显抑制作用；观察到特异性的凋亡小体；Ara—C导致A549细胞发生DNA链断裂，并呈明显剂量依赖性增强：Westernblotting显示caspase8，9，3都不同程度被激活，多聚ADP核糖聚合酶（PARP）被剪切降解。结论揭示了Ara—C明显诱导A549细胞凋亡；细胞凋亡通路不仅通过线粒体途径，还通过膜受体途径，两条通路协同作用使凋亡信号增强；提示Ara-C对A549细胞有明显的化疗作用。不可能存在绝对的核蛋白啊，因为蛋白合成是在胞浆，所以核里面再怎么多，胞浆里总会有那么一点嘛。而且很多蛋白是一直在胞浆胞核之间穿梭，特别是信号通路中的很多蛋白，始终是在胞浆与胞核之间保持一个动态的平衡，不断地在核与浆之间循环。这种动态的平衡其实也是生物体的精妙的调控机制。采用干细胞治疗有着多种优势：低毒性（或无毒性），即使不完全了解疾病发病的确切机理治疗也可达到较好的治疗效果，自体干细胞移植可避免产生免疫排斥反应，对传统治疗方法疗效较差的疾病多有惊人的效果。随着胚胎干细胞和iPS细胞的研究，更可能从患者自身细胞开始获得全能的干细胞，进而分化为所需细胞甚至器官，完全和自身匹配没有免疫排斥的细胞或器官移植已不再是梦，当人体器官衰老的时候，将衰老器官用自身细胞培育出的相应器官替代移植，人类将有可能延年益寿。iPS细胞是通过基因转染技术（genetransfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。配体与膜上受体结合后，网格蛋白聚集在膜下一侧，逐渐形成50-100nm的质膜凹陷，称网格有被小窝，一种小分子GTP结合蛋白在深陷有被小窝的颈部装备成环，dynamin蛋白水解与其结合的GTP引起颈部缢缩，最终脱离质膜形成网格蛋白有被小泡。1内质网选用放射性标记的CDP胆碱，用放射自显观察，微管用罗丹明标记的抗微管蛋白，用免疫荧光观察，比较图像是否有相关。2用罗丹明标记微管蛋白连续注入培养细胞，用荧光显微镜观察。3用oligo-dT对提取的RNA进行亲和层析，提取MRNA进行southern杂交。4用荧光原位杂交确定。5用早熟染色体凝集实验，PCC。6扫描电镜技术，概念你自己找。7用绿色荧光蛋白标记CENP-E蛋白。8用BRduincorporation培养，会引起DNA突变，对其进行序列分析。9用RNA干扰技术，本质是与mRNA结合阻止期翻译。10，用荧光共振能量转移或酵母双杂交实验。杉醇还可抑制细胞在层粘连蛋白上的粘附作用。紫杉醇可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配,防止解聚,使微管稳定,从而阻止癌细胞的生长。微管是真核细胞的一种组成成分,它是由2条类似的多肽(α和β)为单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常情况下,微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体存在动态平衡,紫杉醇可使2者之间失去动态平衡,导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝,抑制了细胞分裂和增殖,使癌细胞停止在G2期和M期,直至死亡,进而起到抗癌作用