6第六章-实验方法的选择与检测系统的评价验证

生物化学检验第五章实验方法的选择与检测系统的评价验证乐山市中医医院吴林军21334234实验方法的选择检测系统性能验证和确认检测系统性能的评价方法试剂盒的选择5检测系统的持续有效性主要内容临床实验室的核心工作是为临床提供准确及时的检验信息，而实验方法的改进与选择和检测系统的性能评价即是此项工作的基础。为确保所选择的实验方法或检测系统的检测结果符合临床要求并具备可比性，能客观地反映被检测者的生理和病理状况，实验室工作人员应对实验方法进行严格的评估和选择，并对所组成的检测系统通过实验途径进行系统的性能评价，保证检测系统的持续有效性第一节实验方法的选择21334234实验方法的分级实验方法选择的步骤实验方法选择的原则实验方法选择的目的一、实验方法的分级国际临床化学协会（internationalfederationofclinicalchemistry，IFCC）将临床检验的诸多方法根据其准确度与精密度的不同分为三级决定性方法参考方法常规方法一、实验方法的分级（一)常规方法•常规方法（routinemethod）指性能指标符合临床需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，经济实用的检验方法•目前临床实验室开展的检验项目的检测方法大多属于常规方法。常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法一、实验方法的分级(二)参考方法•参考方法（referencemethod）是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差与重复测定中的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度和特异度、较宽的分析范围并且线性良好•参考方法可以在生产厂家和临床实验室使用，条件许可的临床实验室也可用参考方法进行常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；用于鉴定二级标准品、对质控血清定值和对商品试剂盒的质量评价等一、实验方法的分级(三)决定性方法•决定性方法（definitivemethod）是准确度最高、系统误差最小、经过研究证明尚未发现其不准确度或不精密度的方法，其测定结果与“真值”最为接近。属于这类方法的主要有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法(ID-MS)等•由于技术要求太高，费用昂贵，这类方法并不直接用于临床检验，也不用于鉴定常规方法的准确性，主要用于评价参考方法和对一级标准品定值，具有权威性常规方法参考方法决定性方法不同方法的关系一、实验方法的分级二、实验方法选择的目的实验方法选择的根本目的：1.各实验室按照方法选择的原则、结合自身条件，确定合适某项目的的检测方法2.保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了解，作出初步评估三、实验方法选择的原则选择实验方法要根据临床需求，结合实验室的条件和检测要求确定适当的方法。常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标，至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床实验室根据采用这一试验的目的决定1.实用性2.可靠性临床实验室对所选择的新的实验方法，在用于检测病人标本前必须对其分析性能进行验证或评价，证实其能满足临床和实验室要求的性能后方可用于临床检测。1.提出要求2.收集资料3.选择候选方法四、实验方法选择的步骤4.确定质量目标实验室采取的质量目标应根据其服务的群体、实验的特定应用、以及临床需求的不同而有所不同。质量目标应参照中华人民共和国卫生行业标准（WS/T403-2012《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》）。未有标准的项目可参照美国实验室改进法案（CLIA＇88）中推荐的总允许误差、国际专业团体、国家、或专家推荐性指南文件的要求5.进行初步评价四、实验方法选择的步骤第二节试剂盒的选择2133423试剂盒的类型试剂盒的使用试剂盒的选购试剂盒是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的成套试剂生化试剂盒按剂型分类可分为液体试剂、干粉试剂、干片试剂、一次性试剂包等，液体试剂在临床实验室中应用最为广泛1.液体单试剂2.液体双试剂一、试剂盒的类型选购试剂盒时一般应考虑以下原则：1.方法特异性好、灵敏度高、准确度和精密度质量标准2.对试剂盒的包装、理学性能、方法学性能充分了解，确认性能参数符合试剂说明书承诺和本实验室的要求3.国家食品与药品监督管理局(CFDA)的批准文号4.配套使用的校准品，校准物质符合标准和要求，最好能提供溯源性的材料和说明5.试剂盒的有效期至少一年6.试剂对环境的污染小，对工作人员无明显毒害作用，无强烈腐蚀性二、试剂盒的选购试剂盒在使用前和使用过程中应关注以下内容：1.查阅说明书2.理学检查3.稳定性4.均一性5.性能评价三、试剂盒的使用1.适用性（1）微量快速适用于急诊和成批分析。（2）方法简便无需特殊培训，试剂种类少，易于自动化分析。（3）安全可靠试剂无毒害，保存简便。（4）成本低廉试剂、仪器和辅助设备成本。2可靠性具有较高的精密度、准确度和特异性，以及较大的检测范围。精密度：不精密度一般应小于3%。准确度：不准确度一般应小于5%。特异性：尽可能只对待测物特异。检测范围：能适合正常和大多数病理标本。性能评价是保证检测系统完整性、有效性的重要手段。检测系统（包括检测仪器、配套校准品、试剂、运行环境等）的性能评价是方法学评价的具体实施。当实验室建立新的检测系统或完整检测系统中任一组合发生改变或运行中的检测系统在新项目应用之前、仪器重要参数发生变化、更换新的试剂盒等时，都应对系统性能进行评价性能评价的主要内容一般包括：精密度、正确度、线性范围、检测限、抗干扰能力、生物参考区间等第三节检测系统性能的评价方法第三节检测系统性能的评价方法21334234精密度的评价检出限的验证可报告范围评价正确度的评价5生物参考区间的验证•精密度(precision)是指测量程序在相同条件下，对同一样本进行连续多次测量时所得结果之间的一致性，是表示测定结果中随机误差大小程度的指标•通常用标准差(standarddeviation，s)和/或变异系数(coefficientofvariation，CV)的大小来描述不精密度，从而度量精密度的大小。标准差或变异系数愈小，表明精密度越好，检测结果重复性越好。重复性试验是评价精密度的常用方法，包括批内精密度试验和日间精密度试验一、精密度的评价–重复性试验(一)基本方法1.批内精密度试验是指在相同条件下，对同一样本在尽可能短时间内进行多次重复测定。将实验样本随机插入常规患者样本中进行检测，一批内重复测定20次，计算均值、标准差、变异系数2.日间精密度试验是将同一样本分成数份，随机插入常规患者样本中，每天测定一次，最少连续测定20天，计算均值、标准差、变异系数一、精密度的评价基本方法对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定，一般为20次。批内重复性：20次测定，计算x、s、cv%。批间重复性：一天内分数批重复20次测定，计算x、s、cv%。一般分5批每批作4次测定。cv%比批内大。日间重复性：每天1次，重复20天，计算x、s、cv。其cv反映实际工作情况。cv比批间大。－－－(二)注意事项1.试验条件要稳定要尽量保证在相同条件下，即在同一检测系统下（包括测量程序、人员、仪器、环境等）以及在测量条件保持不变的条件下规定时间内完成，每次实验过程均应有质量控制2.实验样本应与真实标本有同样的基质可使用稳定的冷冻血清或血浆，也可选用稳定性好、以血清为基质的质控品或校准品3.检测系统应处于良好状态进行重复性试验的样本浓度宜选择在医学上具有决定性意义的浓度水平，通常选择2～3个不同浓度水平的试验样本医学决定水平，就是临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。一、精密度的评价(三)性能可接受性判断将计算得到的标准差参比国家行业标准（WS/T403-2012《临床生物化学检验常规项目分析质量指标》）或与美国CLIA＇88规定的总允许误差进行比较。批内不精密度CV应小于CLIA＇88允许误差的1/4，日间不精密度CV应小于CLIA＇88允许误差的1/3作为评价标准一、精密度的评价(四)CLSI的EP5-A2精密度评价方案介绍美国临床和实验室标准化协会（CLSI）制定了一系列标准和指南。其中，EP5-A2文件《定量测量方法的精密度性能评价》，是目前精密度评价实验方案中最全面和最具统计学效能的。主要用于厂商新开发的检测方法或仪器精密度的评价；临床实验室用于对所用自建检测系统或更改了FDA批准的检测系统的精密度性能进行评价。该方案采用2×2×20的实验方法，即每天检测2批，每批检测2次，共进行20天，获得80个有效数据。方案同时提供了直观实用的记录表格，通过计算可得到批内、批间、天间及总不精密度。如果大于厂家声明要求，仍可通过检验来判断是否具有显著性差异，如无显著性差异仍是可以接受的一、精密度的评价(五)CLSI的EP15-A2文件简易评价方案EP5-A2精密度评价的实验方案对于临床实验室来说实验过程繁琐，统计较为复杂。EP15-A2文件《用户对精密度和正确度性能的验证方案》，可以使临床实验室通过最小的努力即可验证厂家声明的精密度性能一、精密度的评价EP5-A精密度评价方案介绍1.实验标本每天测定2次（2次测定间隔不得少于2小时），每次测定均作双份，共测定20天，收集80个数据（见表3-5）。2.统计处理每双份的差值（批内差）反映了批内精密度每天2次均值的差值反映了天内的精密度20天有20个批间差，减去批内差，反映了批间精密度…•正确度（trueness）是大批检测结果的均值与真值的一致程度。正确度通常用偏倚（bias）表示，已经消除了不精密度的影响•准确度(accuracy)是检测结果与被测量真值之间一致的程度。测量准确度与测量正确度和精密度有关。准确度量化为不准确度，实际反映的是分析总误差在临床实验室工作中，由于检测的样品是源自人体的标本，成分和结构复杂，对正确度的评价，可以采用多种方法，从不同角度进行评价。常用的方法有回收试验、干扰试验和方法比对试验二、正确度的评价准确度的评价（一）准确度评价指标有：方法比较试验、回收试验和干扰试验。（二）方法比较试验实验方案：EP9-A21.基本方法：用两种方法同时对一组新鲜标本进行测定，根据测定结果的差异，得到恒定或比例系统误差。2.实验要点：（1）比较方法的选择：尽可能选择性能高的方法，如参考方法。（2）实验标本与测定（见定量检测的方法学比对）标本例数、浓度分布、测定时间、测定顺序…比例系统误差恒定系统误差比较方法结果试验方法结果3.结果分析理想情况4.临床可接受判断：SE½TEa为可接受水平。(一)回收试验回收试验是指在己知浓度的样本中加入不同浓度的已知被测物质，然后用被评价方法或被评价的检测系统测定被测物质的浓度，最后计算实测浓度与加入浓度之比，以回收率评价检验方法或检测系统的比例系统误差二、正确度的评价1.基本步骤将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品。原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品。然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。32.回收率计算加入浓度=标准液浓度回收浓度=分析样品测得浓度–基础样品测得浓度回收率（%）=一般要求回收率95-105%比例系统误差=100%-平均回收率%）标准液量（）血清量（）标准液量（mlmlml％加入浓度回收浓度1003回收率接近100％分析不受基质影响。无论在纯溶液还是复杂的基质环境中，分析方法的反应能力是一样的。（准确度不受影响）回收率明显偏离100％分析明显受不同的基质影响。在不同的基质环境下，分析方法的反应能力有明显差异。（准确度受影响）回收率的理解：基质：分析样品中，除了被测物质之外的，都称为~3.试验要点（1）加入标准液的体积在整个样品中要少于等于10%。（2）要准确吸量。一般每样品重复测定2-3次取均值。（3）分析样品浓度必须在测定方法的分析范围内。一般需做高中低三个浓度的回收试验，计算平均回收率。（4）分析样品浓度最好在医学决