2018-2019学年高中生物 第2章 胚胎工程 2.2 胚胎工程实验技术课件 北师大版选修3

第2节胚胎工程实验技术1.理解胚胎工程的概念。2.简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。3.简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。4.认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。一二三四五一、胚胎工程的概念胚胎工程通常指各种胚胎操作技术,研究对象主要限定于高等脊椎动物,特别是哺乳动物,研究内容的重点有超数排卵、体外受精、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、基因操作、细胞核移植等。一二三四五二、人工授精和胚胎体外培养胚胎工程的核心技术是胚胎体外培养。1.人工授精(1)精子的获取:主要包括:采精和精液的保存。(2)卵细胞的获取:方法为超数排卵,即注射垂体所分泌的促卵泡激素和促黄体生成激素,使雌性动物排卵数增加几倍至几十倍。采卵技术有手术采卵(冲洗输卵管采卵)和非手术采卵(子宫冲卵)两种方法。(3)当获取精子和卵细胞后,必须在体外条件下,利用化学药物(咖啡因、肝素等)使精子达到获能状态,这样才能够穿入到卵细胞内部。人工授精的方法有体外受精和显微授精两种。一二三四五2.体外受精体外受精就是采取雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子,使其在试管中受精。其过程是:取出成熟附睾精子,放入培养液中,在CO2培养箱内放置2h,使精子活力增强;采集成熟的卵细胞,放入含有精子的卵细胞培养液中,6h后检查受精情况,若已受精,可看到第二极体和雌雄原核形成。将受精卵或胚胎移植到雌性动物子宫内生长发育,最后,经分娩产子即是“试管动物”。3.显微授精:又称辅助授精,是将完整精子或精核用显微操作仪注入卵周隙或卵胞质,激活卵母细胞并完成受精作用。4.胚胎体外培养:应用人工创造的环境,对获取的早期胚胎进行体外培养。一二三四五三、胚胎移植技术1.概念胚胎移植技术是指从经济价值较高、遗传性状优秀的母畜体内获取经过激素处理超数排卵受精发育的胚胎,移植到同期发情的代孕母体的子宫内,经过妊娠产仔的技术。简单地说就是“借腹怀胎”。2.胚胎移植前的准备胚胎移植前的准备包括胚胎的采集、供体和受体动物的准备以及胚胎的保存。(1)胚胎的来源:一种是采用超数排卵技术,以增加可用卵的数量;一种是利用体外受精技术培育胚胎。(2)胚胎采集的方法:小型动物一般采用手术法;大型动物一般采用非手术法采集。一二三四五(3)供体选择的方法:应先从那些遗传性能优良而稳定的健康母畜中选择,然后再根据营养情况、繁殖力、年龄、发情周期、对超数排卵的反应及自然排卵是否正常来进一步选择理想的供体群,并建立严格的供体档案。(4)受体选择的方法:原则上选择那些生产性能较低,数量较多、健康无病,发情周期正常的适龄母畜作为移植受体。(5)发情同步化:只有当供给胚胎的母畜和接受胚胎的母畜的生殖器官处于相同的生理状态下,胚胎移植才有可能成功。处理方法是除了对自然发情的家畜进行选择外,还通常采用诱导发情处理的方法,即用激素类药物抑制卵泡发育和抑制黄体酮分泌的方法。(6)胚胎的保存:指在一定条件下使胚胎停止发育并保持重新恢复发育活性的一种方法。一二三四五3.胚胎移植的实施中小型的动物都采用手术法。即经消毒后切开腹中线,取出子宫和输卵管。对于大型动物一般采用非手术法,采用特殊器械进行移植。4.胚胎移植技术的应用人工授精技术使优秀公畜的遗传潜力得到最大限度的发挥,而胚胎移植技术可使优良公、母畜的繁殖潜力都得以充分发挥。其应用的主要表现有:(1)首先,充分发挥优良母畜的繁殖潜力,迅速扩大优良种群。(2)其次,是保存品种资源,建立优良种质资源基因库。(3)另外,代替优良种畜的引进。一二三四五四、胚胎分割技术1.概念胚胎分割技术就是把一个胚胎的细胞分成两组或多组,经过短暂培养使其修复、发育后,再一同或分别移植到不同的代孕母畜中妊娠并产生多胎的技术,又称做人工同卵多胎技术。一二三四五2.胚胎分割的程序(1)切割器具的准备:体视显微镜、倒置显微镜和显微操作仪,胚胎固定管和分割针。(2)胚胎的预处理:为了减少切割的损伤,胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理,使透明带软化并变薄或去除透明带。(3)胚胎的分割:在进行胚胎切割时,先将发育良好的胚胎移入含有操作液的培养皿中,然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。(4)分割胚的培养:为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率,分割后的半胚需放入空透明带中,或者用琼脂包埋移入中间受体输卵管内,或直接在体外培养到桑椹胚或囊胚阶段。(5)分割胚的移植:按照胚胎移植的无菌操作程序,将发育良好的胚胎移植到受体内后,受体受孕产仔。一二三四五3.胚胎分割技术的应用通过胚胎分割来扩大优良家畜的数量;培育遗传特性相同的动物群;还可以用于胚胎的性别鉴定。五、胚胎干细胞核移植技术1.概念胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞,指由受精卵分裂发育成早期胚胎(囊胚)时,其内细胞团的细胞。具有发育的全能性和二倍体核型,能分化出成体动物的所有组织和器官,形态表现为胞体小,泡状、核大。2.胚胎干细胞核移植的程序(1)饲养层细胞培养体系的建立:用胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞,这类细胞能促进干细胞的生长,同时还可以分泌一些能够抑制细胞分化的物质,抑制干细胞的分化。(2)胚胎干细胞的获得:小鼠的胚胎干细胞一般选取桑椹胚、囊胚和延迟着床的囊胚;人和猪的胚胎干细胞可从囊胚和原始生殖细胞中获得。(3)胚胎干细胞的核移植:是指把胚胎干细胞核移植到去核的卵母细胞中,经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后由代孕母体直接获得克隆动物的技术。一二三四五一二三四五3.胚胎干细胞的应用(1)是培育克隆动物很好的核供体。(2)可以进行基因敲除,获得基因敲除动物。(3)构建各种细胞、组织、器官作为人异种器官移植的器官供体来源。123451.对胚胎工程概念的理解(1)胚胎工程的研究对象主要是高等脊椎动物。(2)经过处理后获得的胚胎,还需移植到雌性动物体内生产后代,以满足人类的各种需求。(3)胚胎工程的许多技术,实际上是在体外条件下,对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。(4)操作对象:早期胚胎或配子。(5)技术手段主要集中在细胞水平上,所以有人将它归到细胞工程的范围中。123452.体外受精和早期胚胎培养(1)卵母细胞的采集和精子的采集。卵母细胞的采集和精子的采集、获能卵母细胞的采集方法①手术采卵:冲洗输卵管采卵(小鼠、兔,以及家畜猪、羊等)②非手术采卵:子宫冲卵(大家畜或大型动物,如牛等)精子的采集、获能采集方法①假阴道法②手握法③电刺激法获能方法①培养法②化学诱导法12345(2)对精子进行获能处理。方法名称方法内容适用对象培养法将取自附睾的精子,放入人工配制的获能液中,培养一段时间啮齿动物、家兔、猪等化学诱导法将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中,用化学药物进行诱导牛、羊等家畜12345(3)卵母细胞的采集和培养。动物种类卵母细胞的采集方法采集后的培养实验动物(小鼠、兔)以及家畜猪、羊等超数排卵:用促性腺激素处理,使其排出更多的卵细胞,再从输卵管中冲取卵细胞直接与获能的精子在体外受精大家畜或大型动物(牛、马等)从已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞在体外经人工培养成熟后才能与获能的精子受精直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞12345(4)受精。获能的精子和培养的卵细胞,一般情况下都可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。(5)胚胎的早期培养。①培养液成分:无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及血清等物质。②过程:精子和卵子在体外受精后,将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精情况和受精卵的发育能力→胚胎发育到适宜阶段时,将其取出向受体移植或冷冻保存。胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎,采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻,使其在-196℃的液氮中代谢停止或减弱到足够小的程度,但又不失去升温后恢复代谢的能力,从而能长期保存胚胎的一种生物技术。123453.胚胎移植(1)生理学基础①供、受体生殖器官的生理变化相同,为胚胎提供相同的生理环境。②早期胚胎没有与母体子宫建立组织联系,为胚胎收集提供可能。③受体对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应,为胚胎的存活提供可能。④胚胎能与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但其遗传物质不受影响。12345(2)基本程序(以牛为例)①供体和受体的选择:受体健康状况良好,已进入发情季节。要用激素(一般为雌性激素)使它们进行同期发情。②配种或进行人工授精。③胚胎的收集、检查、保存和培养:常说的“冲卵”实则是冲胚;将胚胎移至培养液或保存液中,并根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别;冷冻保存或体外培养。④胚胎的移植和移植后检查。胚胎的移植方法有手术法和非手术法两种。1234512345方法一:手术法(一般用于中小型动物)。引出受体子宫和卵巢,将胚胎注入子宫角,缝合创口。方法二:非手术法(一般用大家畜如牛、马等)。将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应部位,注入胚胎。(3)胚胎来源:①雌性动物体内的胚胎(需要经过冲卵);②通过体外受精获得的早期胚胎;③通过核移植技术获得的重组胚胎;④通过转基因技术获得的胚胎。(4)地位:胚胎移植是胚胎工程其他技术的最后一道“工序”。(5)胚胎移植的意义:①加速育种工作和品种改良;②大量节省购买种畜的费用;③一胎多产;④保存品种资源和濒危物种;⑤胚胎移植可充分发挥雌性优秀个体的繁殖潜力。123454.胚胎分割(1)概念:胚胎分割是对胚胎进行显微操作,人为地将胚胎分为2份或多份,以制造同卵双胎或多胎的方法。是胚胎移植中扩大胚胎来源的一个重要途径。羊的胚胎分割成功的事例较多,如我国的蒋世娥等不用显微镜操作仪,在普通立体显微镜下,用细玻璃针等切割胚胎获得成功。(2)基本过程:胚胎分割有两种方法,一种是对2~8个细胞胚胎操作,用显微操作仪上的玻璃针(或刀片),将每个卵裂球分离或半胚进行切割,分别放入一空的透明带中,然后进行移植。另一种方法,是用显微操作仪上的玻璃针(或刀片)或徒手持玻璃针将桑椹胚或囊胚一分为二或一分为四,并把每块内细胞团移入空的透明带内,进行移植。目前也可不装入透明带中,直接进行移植。12345(3)意义:来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质,胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。(4)胚胎分割技术的缺陷①刚出生动物的体重偏低,毛色和斑纹还存在差异;②采用胚胎分割技术产生同卵多胎的可能性是有限的。123455.胚胎干细胞(1)胚胎干细胞的特点胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化,能自我复制、自我更新,在体外连续传代并保持未分化状态和具有发育全能性的细胞。桑椹胚细胞、囊胚内细胞团或胎儿原始生殖细胞等均是胚胎干细胞;它的结构特点是细胞体积较小,细胞核大,核仁明显;在功能上具有发育的全能性,可分化为成年动物任何一种组织细胞,另一方面,在体外培养条件下,ES细胞可不断增殖而不发生分化,可进行冷冻保存,也可以进行某些遗传改造。12345(2)胚胎干细胞的应用①胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料,在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中,能维持不分化的状态。在培养液中加入分化诱导因子,如牛磺酸等化学物质时,就可以诱导细胞向不同细胞和组织分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段。②可以用于治疗人类由于细胞坏死、退化或者功能异常引起的顽症。③随着组织工程技术的发展,通过体外诱导分化,定向培育人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。④ES细胞可用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。题型一题型二题型三题型四题型五题型一精子和卵细胞的获取【典例1】体外受精时采集某良种山羊的卵细胞常用的方法是()A.超数排卵处理法B.非手术采卵法C.从早期胚胎中采集D.从屠宰后母畜卵巢中采集卵母细胞解析:对猪、羊等小型家畜常用的采集卵细胞的方法是,用促性腺激素处理,使其排出更多的卵细胞,再从输卵管中冲取卵细胞,直接与获能的精子在体外受精,即超数排卵处理法。答案:A解题关键是了解不同种生物卵细胞采集的方法。动物种类不同,采集卵母细胞常用的方法也不同。小鼠、猪、羊等动物常用超数排卵法,大型动物常用活体采卵法或从屠