DB21T 2734.1-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第1部分大肠杆菌PCR 检测方法

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2734.1—2017病菌PCR分型诊断方法第1部分：大肠杆菌PCR检测方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart1：MethodofPCRdetectionforEscherichiacoli2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2734.1—2017I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13缩略语............................................................................14原理..............................................................................15仪器和器材........................................................................16试剂和材料........................................................................17操作步骤..........................................................................27.1样品的采集、前处理、存放与运输................................................27.1.1采样注意事项..............................................................27.1.2采样工具..................................................................27.1.3内脏样品的采集与前处理....................................................27.1.4内容物的采集与前处理......................................................27.1.5粪便的采集与前处理........................................................27.1.6血液......................................................................27.1.7大肠杆菌纯培养物..........................................................37.1.8保存与运输................................................................37.2PCR检测.......................................................................37.2.1DNA提取...................................................................37.2.2PCR.......................................................................37.2.2.2PCR反应条件...........................................................37.2.2.3电泳..................................................................48试验成立的条件....................................................................49结果判定..........................................................................4附录A（规范性附录）试剂配制........................................................5A.1电泳缓冲液（50倍）............................................................5A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）.........................5A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍)...............................5A.21%琼脂糖凝胶..................................................................5DB21/T2734.1—2017II前言标准《病菌PCR分型诊断方法》按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。标准《病菌PCR分型诊断方法》分为两个部分：——第1部分：大肠杆菌PCR检测方法；——第2部分：产气荚膜梭菌PCR分型检测方法。本部分为病菌PCR分型诊断方法的第1部分。本分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：赵凤菊、赵晓彤、关淼、关乃鹏、李蓉、陈瑶、张雅为、魏澍、李冰、高慎阳、蔡景明、王宏军、王竹、邓文超DB21/T2734.1—20171病菌PCR分型诊断方法第1部分：大肠杆菌PCR检测方法1范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于动物粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025-2007动物检疫实验室生物安全操作规范GB/T555-2002动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。E.coli：大肠杆菌（Escherichiacoli）DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（basepair）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）4原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材DB21/T2734.1—20172本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、15mL离心管、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。6试剂和材料6.1DNA抽提试剂：DNAzol®Reagent，外观为淡绿色，于4～8℃保存。6.2无水乙醇：-20℃预冷。6.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.5dNTP(2.5mmol/L)。6.6引物：引物浓度为20μmol/L。上游引物序列为5’-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’下游引物序列为5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’6.7阴性对照：灭菌双蒸水。6.8阳性对照：E.coliATCC25922。6.9无菌生理盐水。6.10TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。6.11溴化乙锭。6.12DL2000DNAMarker。注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121±2℃高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。7.1.3内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀动物主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。称取1g病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4内容物的采集与前处理采取病死或剖杀动物的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。DB21/T2734.1—201737.1.5粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病动物新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6血液无菌采集心血，按1﹕1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5mL灭菌离心管中编号备用。7.1.7大肠杆菌纯培养物挑取37℃18～24h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用，待检。7.1.8保存与运输采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6～8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2PCR检测7.2.1DNA提取7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加入800μLDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200μL，颠倒混匀后，4℃12000g离心10min。7.2.1.3取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取900μL上清液转移至相应的管中，加入500μL无水乙醇混匀。7.2.1.44℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇，洗涤。7.2.1.54℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。7.2.1.64000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10min。7.2.1.7加入